液相色谱分析方法建立
建立液相色谱方法一般步骤
液相色谱仪的使用
必须做!
溶剂和水的前处理：过滤
• 设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45mm或更 细的水性滤膜和有机滤膜
• 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤
• 过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞 色谱柱，尤其是使用无机盐配制 的缓冲液。
方法
反相 HPLC
离子对 HPLC
正相 HPLC
样品特点/色谱柱
何时应用该方法
流动相：水/有机溶剂
色谱柱：C18（ODS），C8，苯基， 三甲基硅烷，氰基
首选为能溶于水/有机混合物的中性或非 离子化合物。
流动相：水/有机溶剂（一种缓冲 物控制pＨ和离子对试剂）
色谱柱：C18（ODS），C8，氰基
离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳 离子化合物的良好选择
液相色谱分析
液相色谱的检测模式
灵敏度、选择性、适应能力
项目 示差折光 电导
响应 灵敏度 线性范围
通用 毫克 104
选择性 纳克 106
流速敏感 温度敏感 梯度淋洗
是 是 不可
是 是 有限制
紫外 选择性
纳克 105 否 否 可以
荧光 选择性
皮克 105 否 否 可以
电化学 选择性
皮克 106 是 是 脉冲可以
改变容量因子 K'
①
①
②
50/50
② ③
③ 60/40
① 40/60
② ③
液相色谱分析
分析方法建立的实例
改变选择性∶a
• 通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
液相色谱教程液相色谱方法开发
液相色谱教程液相色谱方法开发液相色谱(Liquid Chromatography，简称LC)是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
液相色谱方法的开发是为了解决特定问题和满足特定需求而进行的，本文将介绍液相色谱方法开发的一般步骤和注意事项。
液相色谱方法的开发步骤如下：1.确定分离目标：首先确定需要分离和分析的目标化合物，包括确定化合物的物理化学性质和分离特性等。
2.选择色谱柱：根据分离目标，选择合适的色谱柱。
色谱柱的选择应考虑样品的性质、分离机理、应用要求等因素。
3.选择流动相和梯度条件：根据分离目标，选择合适的流动相（包括溶剂和缓冲剂等）和梯度条件（包括流动相的组成和梯度程序等）。
4.优化色谱条件：通过改变流动相组成、流速、柱温等参数，优化色谱条件，达到最佳分离效果。
5.建立分析方法：根据样品的特点和分析需求，建立分析方法。
包括确定检测器的波长或离子选择器、设置进样量和检测浓度范围等。
6.方法验证：对开发的液相色谱方法进行验证，包括准确度、精密度、线性范围、检出限等指标的确定。
液相色谱方法开发过程中需要注意的事项如下：1.样品制备：样品的制备要充分考虑到样品的性质和分析方法的要求，如需要进行前处理、提取、洗脱、浓缩等。
2.色谱柱保养：液相色谱柱的保养对于保证色谱方法的重复性和稳定性至关重要。
包括定期清洁、适当的保存和使用。
3.流动相准备：流动相的配制要严格按照要求，注意流向的调整、PHA值的调节、气泡和杂质的排除等。
4.柱温控制：柱温对色谱分离的效果有很大影响，需要根据分析需求对柱温进行控制和调节。
5.检测器选择：根据分析的目标和样品的特性，选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
6.数据处理：对色谱结果进行正确的数据处理和解释，包括峰面积计算、峰识别和归一化等。
总结来说，液相色谱方法的开发是一个系统的工程，需要综合考虑样品特性、分析需求和分离机理等因素。
实用高效液相色谱法的建立破解版
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
沃特世液相仪器方法建立
沃特世液相仪器方法建立沃特世液相仪器是一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、生物、环境等领域的分析实验中。
本文将介绍如何使用沃特世液相仪器建立分析方法，并探讨其在实验中的应用。
一、沃特世液相仪器的基本原理沃特世液相仪器是基于液相色谱法原理设计和研发的，其主要原理包括进样、分离、检测和数据处理等步骤。
在进样过程中，待测样品通过自动进样器被引入色谱柱中；在分离过程中，样品在色谱柱中按照不同的化学性质被分离开来；在检测过程中，利用检测器对分离后的化合物进行测定；最后，将检测到的信号通过数据处理系统进行分析和处理。
二、建立沃特世液相仪器分析方法的步骤1. 样品预处理：根据待测物的特性，选择适当的样品处理方法，如提取、浓缩、净化等，以便得到适合进样的样品。
2. 选择合适的色谱柱：根据待测物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3. 优化分离条件：确定适当的流动相组成、流速和温度等分离条件，以使待测物在色谱柱上得到良好的分离。
4. 确定检测器和检测条件：根据待测物的特性和分析要求，选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，并确定合适的检测条件，如波长、增益等。
5. 方法验证：进行方法验证，包括线性范围、灵敏度、重复性、选择性等指标的评价，确保该分析方法的准确性和可靠性。
6. 样品分析：按照建立的分析方法，进行待测样品的分析实验，并记录所得数据。
三、沃特世液相仪器方法的应用沃特世液相仪器广泛应用于各个领域的化学分析实验中，如药物分析、环境监测、食品安全等。
以下是几个常见的应用案例：1. 药物分析：沃特世液相仪器可用于药物的含量测定、成分分析、质量控制等方面。
通过建立合适的分析方法，可以准确测定药物中各种成分的含量，保证药物的质量和安全性。
2. 环境监测：沃特世液相仪器在环境监测领域的应用较为广泛。
例如，可以利用沃特世液相仪器对水体中的有机污染物进行分析，如农药、有机溶剂等，以评估水质的安全性。
HPLC分析方法的建立与开发
食品检测中的应用
食品添加剂检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的防腐剂、色素、甜味剂等添加剂的含量，确保食品的 安全性。
食品营养成分分析
通过HPLC技术，可以对食品中的蛋白质、脂肪、糖类等营养成分进行分离和定量，评估 食品的营养价值。
食品中有害物质检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的农药残留、重金属、生物毒素等有害物质，保障人们 的饮食安全。
流动相选择
根据目标化合物的极性和色谱柱的性质选择合适 的流动相，如甲醇、乙腈、水等，以及合适的流 动相比例和梯度洗脱程序。
色谱条件优化
通过调整流动相比例、流速、柱温等参数，优化 色谱分离效果，提高目标化合物的分辨率和峰形 。
检测方法确定
检测器选择
根据目标化合物的性质选择合适的检测器， 如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检 测器等。
合物充分溶解。
样品净化
02
通过固相萃取、液液萃取等方法去除干扰物质，提高目标化合
物的分离效果。
样品浓缩
03
采用蒸发、旋转蒸发等方法将提取液浓缩至合适体积，便于后
续进样分析。
色谱条件选择
1 2 3
色谱柱选择
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱，如 C18、C8、硅胶等，确保目标化合物在色谱柱上 有良好的保留和分离效果。
06
HPLC分析方法的挑战 与展望
复杂样品分析挑战
样品前处理
对于复杂样品，如生物样品或环境样品，需要进行繁琐的 样品前处理步骤，如提取、净化、浓缩等，以消除干扰物 质并提高目标化合物的检测灵敏度。
分离效果
复杂样品中往往存在多种化合物，其理化性质相近，难以 在HPLC分析中实现有效分离，导致分析结果不准确。
液相色谱条件的分析和建立
1 35 2 4 6
1 79 1 80 1
如不用梯度：分离不理想
梯度条件的优化
梯度曲线的变化∶凹线
梯度曲线的变化∶击线
梯度方法开发实例 - 第一步
开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱， 在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱 峰组保留时间太长，分离度也不好。
甲醇和乙腈的紫外吸收图
线性范围 和检出限 度都有影 响
不同混合溶剂的粘度比较
分离度（R>1.5）和峰型（1.05>T>0.95）
可接受的分离条件K
• 可以接受的分离应该是1<k<20,or 2<k<10 better。 • K=(tr-t0)/t0 • T0指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间 • K 与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大 则分析时间太长。
陡度不变
第二次梯度运行结果
• Time • 0 • 16 • 20 B% 42 95 95 •
液相色谱的方法开发
（二）梯度方法
梯度的洗脱方式
• 高压梯度及低压梯度
A 泵
剂
溶 剂 A 比 例 A 混 合
混 合 器 （溶 剂 溶 剂 混 泵 泵 B 溶 剂 B
A
B 低 高 压 梯
梯度一般方法
梯度洗脱的可变参数
方式不同柱效不同
色谱条件 色谱柱：Kromasil C18 4.6×250mm 5um，柱温 ：室温，波长 ： 203nm 流速 ： 1.0ml/min 2.梯度：乙腈：水为流动相 1.流动相：乙腈：水（22：78）为流动相 0min 20 : 80 柱效:11500 20min 40 : 60
液相色谱分析方法建立-系列一基本理论及色谱介绍
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O
OH
Si
O
+
O
“Column Bleed”
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
Cl
CH3
O
+ H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH
O 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在 中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
O 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 O 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
50
色谱柱的pH值
O 填料的pH稳定性 O 硅胶填料 pH：2-8 O 聚合物填料 pH：2-12 O 杂化硅胶填料 pH：2-12
O
Low pH (hydrolysis of ligand)
O Si
O
O
OH
+
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
HO
CH3
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica
• Catastrophic column failure
蒸发光散射
任何挥发性低于流动相的样 品均能被 检测
可检测所有物质。
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱（HPLC）是一种用于分离和分析样品的精密仪器。
具体的使用方法如下：
1.准备工作：
○确保仪器电源已开启。
○安装∗∗谱柱和其他相关配件。
○准备样品和流动相。
2.建立方法：
○进入液相色谱仪的操作界面，选择适宜的色谱柱。
○设置流动相的种类、比例和流速。
○设置样品进样体积和积分时间。
3.进样：
○将样品溶液注入进样器。
○按下开始按钮，液相色谱仪会自动进行分离和检测。
4.数据处理：
○分析结束后，仪器会自动生成色谱图。
○通过数据分析软件对色谱图进行处理，获取目标物质的保留时间、峰面积等数据。
5.清洗和维护：
○实验结束后，关闭仪器电源。
○清洗色谱柱和其他配件。
○定期检查仪器状态，确保正常运行。
需要注意的是，具体操作步骤可能因仪器型号和实验需求而有所不同。
在使用液相色谱仪时，请务必参考相应的说明书并进行培训。
。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一. 方法建立的步骤二．开始前应知道1. 样品的性质在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。
表 1 有关样品组分和性质的重要信息所含化合物的数目化合物的化学结构（官能团）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光谱图化合物在样品中的浓度范围样品的溶解度样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。
一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。
2.分离的目的HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；（2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。
（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。
（4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。
是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？（5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。
有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。
当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。
（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。
三. 样品的预处理和检测1. 预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现：（1）可直接进样的溶液；:（2）需稀释、pH缓冲、加人内标或其它定容操作的溶液；（3）必须首先溶解或提取处理的固体；。
（4）样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害。
可直接进样的样品有操作方便、精密度好的优点，然而大多数HPLC分析的样品需称重或稀释定容后才能进样。
当样品溶剂成分接近于流动相时，一般不会产生基线波动等问题，通常能够得到较好的结果。
有些样品在注入HPLC前需进行部分分离（预处理），以除去干扰物、浓缩样品或消除“柱杀手”，因此了解样品和各种被测物的浓度范围非常重要。
2. 检测：HPLC方法建立期间，在第一次进样前，我们必须有把握所选择的检测器能检测到所有的被测样品组分。
通常首选可变波长紫外(UV)检测器，因这种检测器使用方便，且可用于大多数样品。
UV光谱数据可从文献中查找，也可通过所测样品成分的化学结构估算，直接测得（如果可拿到化合物纯品）或在HPLC分离期间用二极管阵列检测器（PDA）得到。
样品对UV检测响应不足时，可考虑使用其它类型检测器(荧光，电化学等)，或衍生化样品使检测信号增强。
四. 建立分离方法1. 选择HPLC分离模式与起始条件首先，我们要确定使用什么方法最合适；如果我们选定HPLC分离模式，将样品分为一般样品或特殊样品。
一般样品为小分子典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。
而样品特殊需用特殊的色谱柱和特定的条件才能很好地分离。
一般样品可进一步分为中性或离子样品。
离子样品包括酸、碱、两性化合物和有机盐类(电离的强酸或强碱)。
如样品为中性，一般不需在流动相中加缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。
碱性或阳离子样品，推荐用“弱酸性”的反相色谱柱，流动相中加人胺添加剂可能对分离有利。
首次实验完成后，再按照结果系统地加以进一步完善。
样品的性质HPLC GC CE SEC TLC一般样品特殊样品中性的离子的无机离子异构体对映体生物样品等度肽类糖类梯度大分子蛋白质离子对核酸糖类正相合成聚合物图1. 利用样品的有关条件，选择初始实验分离条件表2特殊样品的处理样品要求无机离子检测为主要问题；使用离子色谱异构体有些异构体能用反相HPLC分开，可分为一般样品类中；用(I)正相HPLC或(2)环糊精—硅胶色谱柱的反相分离能较好地分离异构体对映体分离这些化合物需要“手性”条件生物样品多种因素如分子构象，极性官能团和宽范围的疏水性使这种样品很特殊大分子“大”分子需要大孔径的色谱柱填料(≥10.m孔径)表3首次HPLC分离的较好实验条件分离条件较好的首要选择色谱柱尺寸(长度,内径ID)粒度固定相15ⅹ4.6cn 5um a. C8或C18流动相溶剂A和B缓冲液—乙睛%B 80—100% b.缓冲液(化合物、pH、浓度)25mM磷酸钾，2.0＜pH＜3.0 c.添加剂(如胺改性剂、离子对试剂)开始时不用流速0.5—2.0 ml / min温度35—45℃样品大小体积重量d.＜25ul ＜100ug备注：a. 3.5um微粒为另一选择； b. 用于初始等度分离；初始用梯度实验较好；c. 中性样品不需要缓冲液；d. 小体积色谱柱（如7.5*0.46cm,3.5um）需要的量更小。
表4主要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱何时应该使用该方法反相HPLC流动相：水—有机溶剂色谱柱：C18(ODS)、C8、苯基、三甲基硅烷(TMS)、氰基能溶于水一有机混合液的大多数样品尤其是中性或非离子化合物的首选离子对HPLC流动相：水一有机溶剂，控制PH的缓冲液和离子对试剂色谱柱： C18、C8、氰基离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基、乙醇基、氨基、硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个良好选择石不溶于水一有机混合液的亲脂样品的首选品异构体混合物和制备规模HPLC的首选(最好用硅胶〕此处推荐的所有色谱柱〔除了未键合硅胶)均用健合相硅胶微粒装填。
当分离目的是为了分离制备纯样品时，优化的最终HPLC方法将不同于用于常规定量分析的方法。
2. 开始建立方法在首次进样之前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例（%B）。
通常不推荐用中等强度的流动相开始方法建立。
更好的选择是先用非常强的流动相（如80%—100%B），然后按需要降低%B。
另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱，梯度分离一般使样品分离得更好。
3. 改善分离在HPLC定量分析中，分离开是首要要求。
基线分离是提供精确结果的有效保障。
含有5个组分或更少的样品，使谱峰之间达到基线分离（R＞1.5)一般较为容易。
分离度会随色谱柱的使用时间逐步降低，也会由于分离条件的微小波动而在不同时间有所变化，因此在建立简单混合物的分离方法时，最好使R≥2。
这样的分离度将有利于改善测试精度和方法的普适性；含10团种或10种以上组分的样品，分离一般会很困难，目标分离度往往必须降低至R＞1.0—1.5。
表5 HPLC方法建立的目标目标评论分离度精密和普适性好的定量分析要求R＞1.5分离时间<5—10min时日常工作较理想定量含量测定：≤2%(1S D)；要求不高的分析：≤5 %；痕量分析：≤15%压力（如果为新柱）<l50bar最好，<200bar通常是基本的要求峰高大信噪比的窄峰最好溶剂消耗每次运行少用流动相最好注：大约按重要性递减排列，但因分析要求不同而异。
有些HPLC测定不必使全部被测组分达到基线分离，这种情况最常见于所测样品中可能存在数种化合物但仅需检测其中的一种时。
比如在普查水或土壤样品中的某污染物(如定性分析不同的除芳剂)时，仅需要分离出个别除莠剂，确定其特征保留时间进行峰鉴别即可。
尽管大多数HPLC设备能在更高的压力下工作，使用新色谱柱的工作压力不应超过170bar（2500psi , 17MPa），压力上限最好在2000psi以下。
限制该压力基于两点原因：第一. 随着色谱柱的使用，微粒杂质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；第二. 较低的压力（< 170bar）适于泵、进样阀、尤其是自动进样装置的稳定工作，密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提高。
因此，最好以小于泵的最大允许压力的50%作为目标压力。
4. 可重现的分离在进行实验时，要能够重现每次实验色谱图。
在方法建立过程中改变实验条件（流动相、色谱柱、温度）时，必须经过足够长的时间使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。
通常以10—20倍柱体积的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。
五．HPLC方法的完善最后的实验方案应达到方法建立开始时所设定的所有目标。
方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的相关实验室以及人员。
1. 定量与方法论证一旦完成了HPLC方法建立，应对其进行论证，进行全面论证通常需通过简略核查方法的专属性、线性、准确性、精密度、回收率、灵敏度等而实施。
在最终论证方法之前，应准备和检查书面分析方案，使之清晰、严密。
实际的论证程序按方法的重要性不同，需时为1天一2周不等。
理想的情况是，通过方法论证能找出可能因仪器和操作者的不同而导致的潜在问题。
在日常HPLC分析中，柱间重现性可能是主要问题之一。
同种方法在不同批号的色谱柱上可能有不同的结果，任何意外的结果都应进行研究，以找出其原因，避免在日后的工作中出现同类错误。
表6 完善方法1. 应预备数据表明所需方法的性能；2. 应有为其它操作者使用的书面分析步骤；3. 以一个以上的系统或操作者，用包括期望组分和期望被测物浓度的样品系统地论证方法的性能；比较不同时间和不同实验室之间的实验数据；4. 应得到色谱柱的期望寿命以及柱间重现性的数据；5. 研究不正常的结果，以纠正潜在的问题；6. 研究所有影响分离的条件（温度、流动相组成、pH等）；规定这些条件的限度；对可能发生的问题（关键谱峰对分离不足；随运行时间延长，最末谱峰保留值增加等）提出建议措施。
备注：主要用于日常工作或质量监控方法上表的要求适用于满足精密准确、稳定可靠并可移植转让的严格HPLC标准方法。
在其它情况下，可能只要求一次成功的分离或能快速、“粗略”地答复某一特定问题，此时可免掉表5和表6中的许多建议，图1中一些步骤也可能是不必要的，仅明白并知道一个方法建立方案的真实目标就足够了。
2. 解决出现的问题随着方法建立的进行，会出现各种问题，其中有些已在表7中列出，其它的问题包括：开始时色谱图中有的谱峰可能比所期望的要宽（塔板数低），或谱峰严重拖尾；在方法应用中还会发现用同一（或不同）厂家的“规格相同”色谱柱替代原柱后，分离情况会变得难以接受，常规实验室无法用（规格相同的）另柱重复此方法；色谱柱寿命也可能很短（如进样不足100次即不能再用）；（同一色谱柱）重复进样的色谱图不一样，定量精度较差，保留时间从一系列运行的开始直至结束一直漂移；在后面样品的色谱图中可能出现了其它峰干扰被测物测定等。