微生物限度检验

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微生物限度检验

1概述:微生物限度检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。饮用水,纯化水,注射用水、及其他完全溶解并能通过滤膜的样品,采用薄膜过滤法进行检查;精制卡介菌多糖核酸等其他不完全溶解或无法通过滤膜的样品,采用直接接种法进行检查。

2设备、仪器及用具

2.1 设备净化工作台、生物安全柜、恒温培养箱(30~35℃)、霉菌培养箱(23~28℃),恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱(180℃~300℃)、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、365nm紫外灯、显微镜、集菌仪、薄膜过滤装置等。

2.2 用具

2.2.1 玻璃器皿用前应洗涤干净,无残留抗菌物质。于180℃干热灭菌2小时以上或250℃干热灭菌30分钟以上(仅适用于玻璃器皿或不锈钢用具),或高压蒸汽121℃湿热灭菌30min,50~60℃烘干备用。

2.2.3 无菌衣、帽、口罩、手套(洗净后配套,用牛皮纸包严)、移液管、试管、接种环、孔径0.45UM且直径50的微孔滤膜灭菌,备用。也可用一次性无菌口罩、手套。

2.2.3 酒精灯、乙醇棉球、打火机、实验记录纸等。

2.2.4经灭菌处理的用具存放时间不超过48小时,否则需重新灭菌后方可使用。

3稀释液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。

4培养基及试液

4.1 细菌检查用酪蛋白大豆营养琼脂培养基。

4.2 霉菌、酵母菌检查用沙氏培养基、(玫魂红钠琼脂培养基)、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)。

4.3 大肠埃希菌检查用胆盐乳糖(BL)培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基、靛基质试液、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、枸橼酸盐培养基。

4.4 大肠菌群检查用乳糖胆盐发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基。

4.5稀释液 0.9%氯化钠溶液或PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

4.6 培养基制备应注意:

4.6.1 配制的培养基应测定PH值,确保灭菌后培养基的PH值符合相关培养基的要求。并且,不能有沉淀,如有沉淀,应于溶化后趁热过滤,灭菌后使用。灭菌条件为:121℃蒸汽灭菌20分钟。

4.6.2 培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。包装时塞子必须塞紧,免松动或脱落造成染菌。

4.6.3 培养基配制后应在2小时内灭菌,避免细菌繁殖。

4.6.4 灭菌后的培养基应保存在2~25℃避光的环境,有条件时置冰箱2~8℃保存备用,

存放时间参照“微生物检验用培养基管理制度”里的相关规定。放置时间不能过长,以免水分

散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完,剩余的培养基不宜再用。

4.6.5 勿用电炉直接熔化琼脂培养基,以免营养成份过度受热而破坏。宜用沸水浴或微

波炉加热熔化琼脂培养基。

5供试品检验量

5.1 细菌、霉菌、酵母菌检验量饮用水1ml/膜、纯化水 10 ml/膜、注射用水 800ml/

膜;精制卡介菌多糖核酸 1ml/皿(相当于0.1g/皿、0.01g/皿、0.001g/皿等)

5.2 大肠埃希菌检验量 10ML/瓶(相当于供试品1g、1ml、10cm2)

5.3 大肠菌群检验量选择三个稀释度的供试液,每个稀释度加1ml供试品至乳糖胆盐

发酵培养基试管中,每个稀释级平行做三管。例:分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g

或0.1ml)、1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、 1:1000的供试液1ml(含供试

品0.001g或0.001ml)

6试验前后的准备与清场

6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿等经紫外线照射30分钟后移至无菌室内。每次试验

所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装(牛皮纸

或锡箔纸)去掉。

6.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置,并使其工作不低于30min。

6.3 操作人员用肥皂洗手,关闭紫外杀菌灯,进入缓冲间,换工作鞋。再用75%乙醇棉擦手,穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。

6.4 操作前先用消毒液棉擦拭供试品瓶及开口处周围,经紫外线照射外表面30分

钟后移入操作间。

6.5 生物安全柜清洁与灭菌

6.5.1每次操作前应清洁卫生,然后用消毒液擦洗工作台面及一些可能污染的死角,开

启紫外灯不小于60分钟后,再开启送风,启动净化设备,运转至少15分钟,方可进行相关

操作。

6.5.2每次操作后,应清洁卫生,然后用消毒液擦洗工作台面及一些可能污染的死角,

自净15分钟以上,关机,并开启紫外灯不小于30分钟,关闭电源。与阳性对照菌相关的实

验用品应及时进行消毒或灭活处理。实验所用阳性对照菌菌种及菌悬液、洁净服等实验用具,

应在121±0.5℃蒸汽灭菌至少30分钟。

7 细菌、霉菌及酵母菌的检验

其方法包括直接接种法和薄膜过滤法。根据检验需要,用稀释液将供试品溶解成(或稀释成)

1:10、1:100、1:1000等稀释级的供试液。

7.1 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行微生物限度检查的供试品。

7.1.1 根据样品合格判断标准、菌数报告规则取相应稀释级(计数用理论有效稀释级

包含在样品拟稀释级中)的供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15-25ml温度不

超过45℃的已溶化的培养基(为营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡

萄糖琼脂培养基),混匀,凝固,倒置培养。每个样品至少有三个稀释级,每个稀释级每种

培养基至少制备两个平皿。

7.1.2 阴性对照取试液用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平皿,均不得有菌生长。

7.1.3 培养和计数

细菌培养3天,霉菌、酵母菌培养5天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间7天进行菌落数并报告。注意:菌落蔓延成片的平板不宜计数。

点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌落数。若同稀释级两个平板的菌落数均小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍以上。

在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌,玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将各种培养基上的细菌、霉菌、酵母菌数进行比较,经菌落数最高的培养基中的菌落数为计数结果。

7.1.4 菌落报告规则

细菌、酵母菌宜选取菌落数小于300CFU的稀释级作为菌落数报告的依据。霉菌宜选取小于100CFU的稀释级作为菌落数报告的依据,均取两位有效数字。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml、10cm2供试品中所含的菌落数。

如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌落数。

7.2 薄膜过滤法

7. 2.1 滤膜的选择与处理:滤膜孔径应不大于0.45um,直径一般为50mm,使用时,根据供试品的特性选择滤膜的材质,并保证滤膜在过滤后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜;油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。代试品经薄膜过滤后,用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为50ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。饮用水、纯化水、注射用水的冲洗量为100ml/膜。

7.2.2 供试品的制备与抽取:取相当于每张滤膜含1g、1ml、10cm2供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g、1ml、10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml进行检查,用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜。

7.2.3贴膜:冲冼后用无菌镊子取出滤膜,菌面朝上,贴于相应培养基的已凝固的平板上培养,每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上不得有空隙和气泡。如有空隙和气泡,可用镊子尖背面轻轻压平或将气泡赶出。但不得用力压,以免损坏培养基和滤膜。

7.2.4 阴性对照取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。并每种贴膜用的同批次培养基平板各1个,与供试品培养平板同时培养,均不得有菌生长。

7.2.5 培养和计数

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