高效解硅菌株代谢产物对二氧化硅暴露细胞的保护作用

高效解硅菌株代谢产物对二氧化硅暴露细胞的保护作用[摘要] 目的观察高效解硅菌株代谢产物对中国仓鼠肺细胞在二氧化硅暴露下的保护作用。

方法采集土壤、沙石标本，分离纯化其中的硅酸盐细菌；用液体培养基对高效解硅菌株进行培养，收集培养细菌12 d后的原液并过滤，滤液作为硅酸盐细菌代谢产物。

取对数生长期的中国仓鼠肺细胞( CHL)，用胰酶消化后制成细胞悬液加入2个96孔培养板中培养。

分为对照组、二氧化硅暴露组、硅酸盐细菌代谢产物组（根据不同菌株的产物，分为 、个亚组）；二氧化硅+硅酸盐细菌代谢产物组（根据不同菌株的产物，分为 、 22个亚组）。

对照组正常培养；二氧化硅暴露组仅在正常培养时加入二氧化硅粉尘；硅酸盐细菌代谢产物组正常培养时加入硅酸盐细菌代谢产物；二氧化硅+硅酸盐细菌代谢产物组，在正常培养时加入二氧化硅粉尘后再加入硅酸盐细菌代谢产物；于给药24 h后采用4一甲偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况。

结果与二氧化硅暴露组比较，硅酸盐细菌代谢产物提取液 与SiO2体积比在3/7—9/1(硅酸盐细菌代谢产物提取液 剂量为30～90µl)时，吸光度(OD)值显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）；硅酸盐细菌代谢产物提取液 与SiO2体积比在2/8～9/1（硅酸盐细菌代谢产物提取液 剂量为20～90 µl）时，OD值显著增加（P<0.01），且在20～50范围内，随菌液 体积增大，OD值递增，50～90范围内，随菌液 体积增大，OD值递减。

结论硅酸盐细菌代谢产物对暴露于二氧化硅的CHL细胞有保护作用，并呈剂量依赖关系，且存在最佳保护作用的剂量范围。

矽肺病是因长期吸入游离二氧化硅晶体粉尘而致病，占所有尘肺病的50%以上[1-2]，是以肺部广泛的结节性纤维化为主的疾病。

患者常因肺功能衰竭及并发症而失去劳动力甚至生命，目前尚无特效疗法。

矽肺病根治的关键在于消除肺内的二氧化硅粉尘，也就是找到能有效降解肺内矽尘的物质，这方面目前尚属盲区。

硅酸盐细菌是广泛存在于土壤、沙石中的一类能分泌多种物质降解含硅矿石的细菌，含硅矿石的主要成分是二氧化硅[3]。

设想可利用硅酸盐细菌代谢产物降解肺部沉积的硅尘，为矽肺的防治提供新思路。

要实现这一想法，首先要筛选出高效解硅细菌，再研究其代谢产物对二氧化硅晶体的降解效率和对机体的毒性。

为此，提取不同地点土壤与沙石标本分离硅酸盐细菌，用硅钼蓝法测定溶液中硅含量并筛选出解硅能力强的优势菌株，观察其代谢产物对在SiO2作用下的中国仓鼠肺细胞( Chinese hamster lung cells, CHL)的保护效果。

1.1.2 主要试剂硅酸盐细菌培养基（固体）:葡萄糖5.0g，Na2HPO42.0g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，琼脂15g，玻璃粉1.0g，去离子水1000ml，pH7.0。

硅酸盐细菌培养基（液体）:葡萄糖5.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4•7H2O 0.5 g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，玻璃粉1.0g，去离子水1000ml，pH7.0硅酸盐细菌培养基（液体自配）:葡萄糖5.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4•7H2O 0.5 g，FeCl30.005 g，CaCO3 0.1g，去离子水1000m，l pH7.0硅标准溶液：100μg/ml；硫酸溶液（用分析纯配制）：9.0mol/L，0.25mol/L；钼酸铵溶液：4×10-2mol/L；混合还原剂溶液：柠檬酸（0.19mol/L），硫酸亚铁铵（0.13mol/L），H2SO（4 0.09mol/L)，抗坏血酸（0.028mol/L）。

革兰染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；0.5μmSiO2 晶体（恒诚化工制品责任有限公司提供）；石英砂（成都科龙试剂公司产品）；小牛血清(成都哈里生物材料公司)；DMEM液体；胰酶(0.25% )(成都哈里生物材料公司)；4一甲偶氮唑蓝(MTT)(美国sigma 公司) ；二甲基亚砜(美国BIOSHARP公司）。

1.1．3 细胞来源CHL细胞株由四川大学生物治疗国家重点实验室提供。

1.1．4 主要实验仪器分光光度仪721 型可见光分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）；电子天平DJ-210S 型千分之一电子天平（成都倍赛克仪器仪表研究所）；培养箱DNP-9052 电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；摇床THZ-C 恒温振荡器（太仓市豪成实验仪器制造有限公司）；37℃5% 二氧化碳培养箱(SANYO公司)；酶标分析仪(Tecan Austria Ginb H公司)。

1.2 方法1.2.1标本采集与硅酸盐细菌分离纯化按五点法取地表层10~15cm 深处的耕作层土样，装于牛皮纸袋中，风干后保存[4]。

记录采样时间、地点等信息。

先配制固体培养基,60℃下倒入直径为6cm培养皿冷却备用。

按NIU Yin-jian 等[5]的方法,在无菌条件下，将标本分别取10 g 于烧杯中，加入90 ml 无菌水充分振荡混匀20 min，使标本充分分散于水中，静置20 min后取1ml 上清液加入9 ml 无菌水，配成浓度为1/10土壤稀释液，重复上述操作配成浓度为1/100土壤稀释液。

分别取上清液各1 ml加入直径为6 cm的盛有固体培养基的培养皿中,25℃下培养3~5 d。

每天观察，待长出菌落后，挑选最大菌落反复划线法接种于固体培养基，每天观察，直至长出单个菌落后挑选出单个菌落。

1.2.2 解硅效能的比较挑选出上步单个菌落，用蒸馏水稀释成10-5个/ml。

配制自制液体培养基，将自制培养基分别装入500ml规格锥形瓶（每锥形瓶内加入400ml培养液），在每个锥形瓶内加入3.0 g石英砂。

参照孙德四等[6]的方法，取出1ml稀释的单菌落液加入装有自制培养基的锥形瓶，在25℃、300 r/min的振荡摇床上培养12 d。

于培养开始的第0天、第4天、第8天、第12天，各取1 ml培养液，参照于辉等[7] 的方法，用硅钼蓝试验测定培养液内的Si含量,于分光光度计上波长为670 nm 处测定吸光度。

每次硅钼蓝试验同时测定用培养基稀释成的4个不同浓度的硅标准液的吸光度,绘制标准曲线,求得便准曲线方程,用各本所测吸光度度代入曲线方程,求得各标本不同时段Si含量。

每一个标本作5个平行。

每一时段5个平行样本的均值，作为该标本的平均值。

1.2.3 高效解硅菌株细菌代谢产物的提取配制自制液体培养基，将自制培养基分别装入500 ml规格锥形瓶（每锥形瓶内加入400 ml培养液），在每个锥形瓶内加入3.0 g石英砂。

选取上步筛选的解硅效能最高的2株菌株，用蒸馏水稀释至10-5个/ml，取出1ml菌落液加入装有自制培养基的锥形瓶，在25℃、300 r/min的振荡摇床上培养12 d，将菌液用直径为0.2 µ滤菌器过滤细菌，滤液作为细菌代谢产物备用。

1.2.4 MTT法检检测高效解硅菌株细菌代谢产物对CHL细胞毒性作用细胞培养，参照孙婧等[8]的方法，将CHL细胞株接种在装有适量培养液的培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养，细胞生长状况良好，呈单层贴壁生长。

每1～2 d换液1次，每3～4 d细胞融合至85% ～90% 时进行传代培养，弃去原培养液，PBS冲洗2～3次，弃去PBS，加入0.25% 胰蛋白酶适度消化后，弃去胰蛋白酶，加入培养液10 mL，巴氏管轻轻吹打分散均匀，从中吸取5 mL细胞悬液接种于新培养瓶中，放入培养箱中继续培养。

参照Kierklo A 等[9]的方法进行MTT实验。

因加入的代谢产物不同而分为I、II 组，每组各用1个96孔板；根据代谢产物的浓度，每组分为10个亚组，即正常培养组、原液组、原液稀释1/2组、1/4组、1/8组、1/16组、1/32组、1/64组、1/128组、1/256组；每亚组占96孔板1列；第1列为正常对照组，第2列为原液组，第3～10列为菌液100µl，浓度依次为原液1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍，每孔再加入培养基100 µl,共200 µl。

加样完成后，置于5%CO2，37℃孵箱孵育24 h。

24 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态，吸弃培养液，每孔加入5 mg／mL MTT溶液20 µl。

继续置于5%CO2，37℃孵箱孵育4 h，取出并小心弃去上清液，每孔加150µl二甲基亚砜溶液，轻轻震荡使紫色颗粒充分溶解，最后利用酶标仪于490 nm波长检测各孔吸光度值（OD）。

吸光度大小可代表细胞数的多少。

以上操作重复5次，以5次的均值作为衡量其毒性作用的指标，OD值越大，说明对CHL 细胞的毒性越小，反之亦然。

1.2.4 MTT法检测二氧化硅和硅酸盐细菌代谢产物作用对CHL细胞影响将细胞随机分成正常培养组、单纯二氧化硅暴露组、二氧化硅+硅酸盐细菌代谢产物暴露组（因有2种细菌代谢产物，故各用1 个96孔板）。

称取0.96 g直径为5 µm的石英粉，加入100 ml的蒸馏水，搅拌混匀，制成浓度为9600 µg/ml的二氧化硅悬液，经高温高压等体积灭菌后备用。

正常培养组只加正常培养液；单纯二氧化硅暴露组，只加入二氧化硅悬液；二氧化硅+细菌代谢产物暴露组又分为8个亚组（以3～10组表示，每亚组SiO2 悬液体积不变，但细菌代谢产物用量分别为20、30、40、50、60、70、80、90µl）；在加入二氧化硅悬液后，再加入细菌代谢产物。

具体如下：96孔板的第1列为正常对照组，第2列为二氧化硅暴露组，第3～10 列为二氧化硅+硅酸盐细菌产物组；2到10列每列加入二氧化硅100µl，3到10组依次加入细菌代谢产物20、30、40、50、60、70、80、90µl，用培养基调节每孔体积均为200µl。

加样完成后，置于5%CO2，37℃孵箱孵育24小时。

24h后，在倒置显微镜下观察细胞形态，吸弃培养液，每孔加入5 mg／mL MTT溶液20µl。

继续置于5%CO2，37℃孵箱孵育4 h，取出并小心弃去上清液，每孔加150µl二甲基亚砜溶液，轻轻震荡使紫色颗粒充分溶解，最后利用酶标仪于490 nm波长检测各孔吸光度值（OD）。

吸光度大小可代表细胞数的多少。

以上操作重复5次，以5次的均值作为衡量其对CHL保护作用的指标。

OD值越大，说明对CHL细胞的保护作用越大，反之亦然。

1.2.5 统计学分析计量资料均以表示，多样本之间的比较采用单因素方差分析，两两比较时采用Dunnett-t检验，检验标准α=0.05；统计分析采用PEMS3.1软件进行。