神经细胞保护作用细胞试验

神经细胞保护作用细胞试验

一、SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞株）

1. 细胞损伤模型的建立

缺糖缺氧损伤；氧化损伤（H2O2）；氧化因子6-羟基多巴胺（6-OHDA）；冈田酸损伤；A β25-35损伤；谷氨酸损伤。

2. 检测指标

1）损伤模型建立的判定指标

CCK-8法测定细胞存活率，确定时效量效曲线，判定作用的浓度、时间。

细胞形态学---显微镜观察和Giemsa染色。

IC50测定。

噻唑蓝(MTT)比色测定细胞活力。

2）保护作用的判定指标及方法

细胞存活率；细胞液LDH活力；细胞内MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力；噻唑蓝(MTT)比色试验；胞内Ca2+的测定；免疫组化法检测Bcl-2蛋白的表达；Hoechst 33258 染色凋亡镜检；Annexin -V/ PI 染色凋亡检测；胞内ROS检测；线粒体细胞膜电势(MMP)检测；细胞内钙浓度检测；Caspase-3 活性检测；细胞总蛋白的提取，蛋白定量采用改良的Lowry 法；Western blot；分光光度计检测6-OHDA 自氧化。细胞增殖变化；Real-Time PCR 检测AIF、Cyt C、Bax、Bcl-2 mRNA含量；Western Blotting检测AIF、Cyt C、Bax、Bcl-2蛋白含量；双染法检测细胞凋亡

参考文献：于颖．川射干异黄酮类化学成分的神经保护作用[D]．山东：泰山医学院，2013．参考文献：张莲珠．卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对认知障碍模型的治疗及可能作用途径[D]．吉林：吉林大学，2013．

参考文献：赵丽霞．川芎嗪烟酸酯对神经细胞的保护作用研究[D]．山东：山东大学，2005．参考文献：田琳琳．复方丹参方有效成分对神经细胞氧化损伤的保护作用机制[D]．吉林：中国人民解放军军事医学科学院，2006．

参考文献：彭扬中，崔海峰，冯淑怡，等．黄连解毒汤对神经细胞保护作用活性成分的筛选［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：203-207．

参考文献：胡文军．复方脑康胶囊治疗Alzheimer's病的药效学研究[D]．广州：南方医科大学，2012．

二、pc12细胞模型

1. 细胞损伤模型的建立

Aβ25-35损伤；皮质酮损伤；谷氨酸损伤；NaCN加缺糖造成PC12缺血性样损伤；鱼藤酮损伤；二氯化钴缺氧损伤；缺糖缺氧损伤；NO损伤

2. 检测指标

1）损伤模型建立的判定指标

观察细胞形态；MTT比色；细胞增殖率；

2）保护作用的判定指标及方法

观察细胞形态；MTT测定细胞存活率；检测细胞上清液中LDH；苏木精- 伊红染色观察细胞形态学变化；HE染色；尼氏体染色；电镜观察PC12细胞的超微结构；DCFH-DA 染色检测细胞内活性氧类物质( ROS) 水平；流式细胞术检测PC12细胞的凋亡；分光光度法测定细胞过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性和总抗氧化能力(T-AOC)的水平；检测细胞培养液中丙二醛(MDA)的含量；硫代巴比妥法测定细胞丙二醛含量；琼脂糖凝胶电泳观察DNA断裂梯形图谱；Western blot 分析PC12

细胞Bcl-2、Bax、caspase-3 P20 及caspase-9 蛋白表达的变化；RT-PCR 法检测PC12细胞Bcl-2、Bax 及caspase-3 mRNA 表达的变化；细胞内游离钙离子浓度、细胞线粒体膜电位。

参考文献：牛慧娟，戴平，杨中林．葛根素对二氯化钴造成PC12细胞缺氧损伤的保护作用［J］．海峡药学，2011，23（3）：190-192．

参考文献：王杰，程言博，印晓星．银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞氧化应激的影响［J］．徐州医学院学报，2010，30（4）：215-218．

参考文献：崔群力，孙圣刚．姜黄素通过抗氧化作用拮抗鱼藤酮致PC12 细胞损伤的研究［J］．华中科技大学学报，2010，39（1）：37-46．

参考文献：胡文军．复方脑康胶囊治疗Alzheimer's病的药效学研究[D]．广州：南方医科大学，2012．

参考文献：纪影实．山楂叶总黄酮对脑缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制的研究[D]．吉林：吉林大学，2006．

参考文献：王君．远志皂昔碱水解产物的化学成分及神经细胞保护作用研究[D]．北京：北京协和医学院，2011．

参考文献：王莹．文冠果柄昔对神经细胞损伤的保护作用研究[D]．辽宁：沈阳药科大学，2009．

参考文献：周妍妍．地黄饮子对Aβ致PC12细胞损伤影响的实验研究[D]．黑龙江：黑龙江中医药大学，2007．

三、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neur0．2a)模型，

1. 细胞损伤模型的建立

缺糖缺氧损伤；H2O2氧化损伤；谷氨酸损伤

2. 检测指标

1）损伤模型建立的判定指标

MTT细胞活力测定；倒置显微镜观察细胞形态

2）保护作用的判定指标及方法

噻唑蓝(MTT)比色试验；LDH测定；MDA、GSH一Px和SOD活力测定；胞内Ca2+的测定；琼脂糖凝胶电泳(AGE)；免疫组化法检测Bcl- 2蛋白的表达；细胞增殖变化。

参考文献：赵丽霞．川芎嗪烟酸酯对神经细胞的保护作用研究[D]．山东：山东大学，2005．参考文献：彭扬中，崔海峰，冯淑怡，等．黄连解毒汤对神经细胞保护作用活性成分的筛选［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：203-207．

四、原代培养的大鼠乳鼠大脑神经细胞模型，

1. 细胞损伤模型的建立

D —半乳糖所致衰老神经细胞的模型

2. 检测指标

1）损伤模型建立的判定指标

MTT细胞活力测定

2）保护作用的判定指标及方法

透射电镜、扫描电镜观察拍照；细胞化学染色：尼氏体染色、LPF--Glenner 氏联合反应法；酶细胞化学染色：SDH（琥珀酸脱氢酶）---亚铁氰化钾法、ACPase ---Gomori 法。

参考文献：金顺女．东川芎对D-半乳糖所致衰老神经细胞保护作用研究[D]．吉林：延边大学医学院，2002．

五、胎鼠脑神经干细胞(neuralstemcells,NSc)模型，