western blot操作注意事项
免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹（Western blot）是一种重要的蛋白质检测技术，在生物医学研究中被广泛应用。
该实验通过将蛋白质样品经电泳分离，并将其转移到膜上，最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验过程中需要注意以下事项。
二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前，需要准备合适的仪器和试剂。
以下是一些注意事项：1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常，并进行必要的校准和测试。
•清洁仪器，避免污染和干扰实验结果。
2. 试剂准备•使用优质的试剂，并根据说明书正确配制试剂溶液。
•为避免批次差异，建议每次实验使用同一批试剂。
•试剂保存在适当的温度和条件下，以保证其稳定性。
3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。
•确保溶液的 pH 值正确，并进行必要的调整。
•溶液保存在适当的温度和条件下，避免污染和变质。
三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时，需要注意以下操作事项：1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行，以确保样品的完整性和稳定性。
•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。
2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前，必须对电泳胶进行适当的处理和准备，确保其质量和性能。
•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。
•电泳过程中，要严格控制电流和电压，避免产生异常结果。
3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料，并按照正确的方法和条件进行转膜操作。
•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。
4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测，以提高结果的准确性和可靠性。
•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整，避免产生过度或不足的信号。
•成像过程中，要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。
5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时，应使用合适的软件和方法，确保结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
新手小白做Westernblot最需要注意的小细节
新手小白做Westernblot最需要注意的小细节1. 洗板：大多数都是经费紧张闲杂物品能不买就不买的对吧，所以玻璃板大家都是怎么晾干的呢。
专门的晾干架我们肯定是不会买的，因为有师姐传承下来的神器，随意增减空位，不够可以无限量自制。
相信大家一看图就明白怎么做啦，泡沫可以是泡沫箱也可以是试剂箱里的厚减震板，枪头嘛当然是国产的。
每次做完之后把玻璃板洗干净晾好，下次做就可以直接用啦，当然如果间隔太久还是要洗一下烘干再用比较好。
2. 配胶：如果刚上手做WB，一定要在配胶前验漏，懒一下说不定就会体验到一遍又一遍配胶一遍又一遍漏掉的绝望。
如果已经很熟悉自己的器材，可以省略。
配胶用的架子都是损耗品，这是配胶反复漏液，不管怎么调整都没用的时候才知道的。
不过在在损耗初期还是可以凑合用的，方法见下图，万能的枪头，哪儿都可以看到它的身影。
我常用的是1.5mm的板，最开始配胶的时候把握不住分离胶加到什么位置，导致浓缩胶不是太长就是太短，当夹板顶在透明架子最下方就是3号线的位置时，分离胶加到2号线的位置大概6.8ml左右的样子就可以啦，这样1号和2号线中间浓缩胶长度刚刚好。
分离胶加好以后加满水或者异丙醇界面还会往下压一点点，不会太多。
如果非常着急，可以稍微多加2ulTEMED，不过剧毒的东西还是少用为妙吧。
配好以后总有多余的液体，先别急着倒掉，等管里的液体凝好了，差不多可以准备下一步了。
配好的可以第一天配好胶包保鲜膜放4°，这样第二天时间比较充裕。
保鲜膜要多包几层。
3. 上样：先别急着拔梳子，把胶装好内槽灌满缓冲液再拔，好处有三：一看下内槽漏不漏；二拔梳子阻力较小，减小破坏胶的可能性；三上样方便。
提蛋白和变性的过程没有什么好的建议，如果做细胞的话，各组细胞量差不多其实可以不定量，毕竟WB的灵敏度做不出来小的差别，而且定量方法并不是很准确。
可以做预试验，根据条带适当调整下上样量。
我用的是广谱彩虹Marker，避免广告嫌疑就不说牌子啦，自己调整一下用量到条带清晰即可，毕竟这是裁条带的唯一参考。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
新手Western blot步骤及注意事项
Western Blot操作步骤及注意事项【原理】Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
【试剂及配制】1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。
2、电泳缓冲液Tris（分子量121.14）3.03g甘氨酸（分子量75.07） 18.77gSDS 1g蒸馏水定容至1000ml溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。
电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。
3、转膜缓冲液湿转法48mmol/L Tris 2.375g39mmol/L 甘氨酸11.25g0.0375% SDS 0.375g加少部分蒸馏水溶解20% 甲醇200ml蒸馏水定容至1000ml溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。
使用转膜缓冲液时注意室内通风。
转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。
4、TBS缓冲液1mol/L Tris·HCl（pH7.5）10mlNaCl 8.8g蒸馏水定容至1000ml配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。
5、TBST缓冲液（洗膜液）20%Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
western blot的实验步骤及注意事项
western blot的实验步骤及注意事项1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。
注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm 微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
western blot02-------biotnt wb一般操作流程及注意事项
Western blotting一般操作流程及注意事项Biotnt技术中心1．检查仪器及试剂检查各仪器是否完好可用，各试剂是否在使用期限内，各耗材是否准备充分。
2. 样本前处理及蛋白定量将保存好的样本（注意避免反复冻融）取出，用剪刀和镊子将其剪成实验所需大小，置于离心管中，在管壁上标识样本名称，注意取不同样本时的取样工具要在PBS中清洗，避免交叉污染，在天平上称量样品重量，记录，根据所称重量加入5倍体积的单去污裂解液，用电动匀浆机进行匀浆，在匀浆不同样本时要在PBS中清洗，避免交叉污染，匀浆后在离心机中12000转离心15分钟，取上清液测定蛋白浓度，（注意要尽快测蛋白浓度防止降解），测定用BCA试剂盒，做法依说明书所示。
3. 蛋白变性将测好蛋白浓度的样本进行均一化处理，按照测量蛋白浓度的结果，以样本中最小蛋白含量为参照值，拉平所有样本蛋白浓度，计算在16ul体系下需要加的样本和补足的缓冲液的体积数，（若需要多次试验则准备160ul体系的各体积数），置于90℃金属浴中15分钟。
变性结束后，及时保存好样本，供后续试验使用。
4. 电泳4.1配胶将配胶用的玻璃板置于有洗涤剂的清水中（每周一换）用棉条轻轻擦拭（不可用布，防止划伤玻璃），洗好后用清水冲干净，标准是在玻璃板面上有凝聚的水珠而非大滩的水渍，在操作台上铺一层纸巾，将两块玻璃板放在纸巾上，互相结合面朝上，用吹风机吹干板上水珠，若有残留，用纸巾将水珠点干，避免大面积擦拭划伤玻璃。
手持已经干燥的玻璃板，注意手持玻璃板边缘，将其重合好后，置于制胶器中，用楔子固定，注意观察两玻璃底面与制胶器底部是否水平，缝合良好，将做好的制胶器置于制胶架上，（制胶架擦拭干净），固定时将两侧的固定轴同时往里挤压，然后双手同时顺时针转动至所需标的角度上（1.0mm的胶转至1.0mm刻度以此类推），听到双手转至咔的一声，固定结束。
配置分离胶，按照试剂配置表，准备好相应的试剂，注意试剂的保存条件，配胶时要迅速，防止时间过长凝胶，若温度过低导致试剂沉淀，凝结，则需在37℃水浴中将其混合均匀，配好后，用900ul的枪在一面玻璃板上加5枪，注意加的时候要缓慢加，避免漏胶，避免混入气泡，然后用枪在板面各处滴加水滴压胶，至与板面水平，制好后等待20分钟以便凝胶，若温度过低，需要置于室温20℃环境中凝胶，或者延长凝胶时间。
Western Blot操作注意事项
Western Blot操作注意事 项
• 1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还 有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效 果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终 结果的可靠性有影响。 • 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值 应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位， 因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保 证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液 的PH值是否稳定是很重要的。 • 3. 点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因 为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进 而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻 的将样品加到孔的底部。
• 1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预 实验确定最佳条件。 • • 2. 显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。 • • 3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
• 1 安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水， 检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。 确认不漏水后，倒出水，然后使 其尽量流出，其实残留的一点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容 易剥落下来。 漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候 电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。 • 2 制胶时最好最后加入AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶 的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入AP，混合均匀后马上灌胶。 一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。 • 4 有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去 样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝 聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻 璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用20ul的加样器加样的话，这层凝 胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果 用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。
wb实验操作注意事项
wb实验操作注意事项[WB实验操作注意事项]实验室是进行科学研究和探索的重要场所。
在实验中，我们需要遵守一系列的操作规程和注意事项，以确保实验的安全性和有效性。
WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和分离蛋白质。
本文将一步一步回答关于WB实验操作的注意事项。
I. 实验准备在进行WB实验之前，我们需要进行充分的实验准备。
以下是准备阶段的注意事项：1. 实验室卫生保持实验室的整洁和卫生是实验的基本要求。
在实验开始之前，我们应该清理实验台面，并确保所有实验器材和试剂都经过正确的储存和检查。
2. 实验器材和试剂的准备在准备实验器材和试剂时，我们需要特别注意以下几点：- 仔细阅读试剂和器材的说明书，确保使用正确和合适的试剂和器材。
- 对实验器材进行彻底的清洗和消毒，并确保其干燥和完整。
- 准备好所需的试剂，并按照说明书中的要求进行正确的储存和保存。
3. 实验条件的控制WB实验需要在特定的实验条件下进行，例如温度、湿度和光照。
在实验室中，我们应该设定适宜的温度和湿度，并避免直射光照到实验样品，以防止实验结果的偏差。
II. 样品处理1. 样品选择和制备选择合适的样品是WB实验的关键。
我们应该仔细选择样品，并确保其来源的可靠性和纯度。
制备样品时，需要注意以下几点：- 样品的收集和保存应符合实验要求，以避免样品的异化和污染。
- 样品的制备过程应遵循标准的处理和储存条件，例如样品的快速冻结和保存在低温下，以保持样品的活性和稳定性。
2. 样品处理的技术操作在样品处理过程中，我们需要注意以下技术操作的注意事项：- 操作应在无菌和无尘的环境下进行，以避免样品的二次污染。
- 避免样品的过度处理和长时间的超声处理，以避免蛋白质的降解和损伤。
- 注意避免与有机溶剂和酸碱溶液的接触，防止样品的变性和溶剂残留的影响。
III. SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是WB实验的核心步骤之一。
以下是该步骤的注意事项：1. 准备电泳相关的试剂和缓冲液在进行SDS-PAGE电泳之前，我们需要准备好相关的试剂和缓冲液。
Western_blot的操作及注意事项
Western blot的原理、操作及注意事项三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。
我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。
有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。
因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。
1 实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。
2 实验操作（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A.检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。
再转入transfer buffer中。
D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
（2）转移A.在电转移仪上铺好下层滤纸。
一般用三层。
B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。
C.将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。
倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。
F.装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
G.转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。
3 注意事项及常遇到的问题1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
western blot要点
Western blot 操作要点
一、标本制备
1.要求冰上操作，做好准备（试管的标记、称重、准备至少2盒冰）
2.超速离心30min后，分装2组试管（1组80ul，另一组装剩下的），放-70°C冰箱
3.匀浆时，先前几下捣碎，然后再捣20下，迅速放入冰中
4.匀浆用的玻璃管，一个标本洗一次，并甩干，枪头换
二、SDS胶的制备
1.玻璃板和梳子洗干净，不能有纸屑和水痕
2.两块玻璃板下端放平，上端夹子夹紧
3.倒胶的时候贴壁，快倒，红线下缘下一点停
4.高一点的玻璃板看清上下
5.正丁醇加的时候注意速度，不能太快
6.sperating和stacking胶成分相同，注意枪头的节约
7.梳子的插入，注意分两次，先插入一半，然后外包一张纸（防治溅出）全部插入，基本与高玻璃上缘平齐
8.做好后如隔天再用，可放入一塑料盒，夹子拔下，外盖一张吸水纸，放4度冰箱过夜
9.配胶用的水为冰箱里的
三、电泳
1.做好上样准备（长枪头、每次约40ul，两个烧杯，其中一个放干净水）
2.搭好架子，两边的玻璃板都要夹好，一起放入池子，池子外要放一块塑料盒子，搭好后要加入电泳缓冲液，中间倒满，外面倒半，然后拔掉梳子，然后上样
3.电压开始选择100mv，电泳2.5小时
四、转膜
1.顺序：棉、滤纸、膜、胶、膜、滤纸和棉
2.黑色朝操作者，白色对外，黑色为近胶侧（黑胶白膜）。
磷酸化蛋白之westernblot检测操作细节和注意事项
磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。
2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。
因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。
4度也可使一抗重复使用多次（站长注：可加入防腐剂，如叠氮钠，Proclin TM 等，保存时间更长）。
毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。
二抗则室温1小时即可。
3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。
个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体4.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。
如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。
5.抗体的稀释倍数也要适当。
不同厂商也会有不同要求。
6.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。
如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标acti n。
7.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers 的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对.8.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅.9.磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿background深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。
Western_blot的原理、操作及注意事项
Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L 含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good 缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
western blot注意事项
.1、为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致？同样的电压可以吗？解答：浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。
而在分离是理论上（实际上也是）小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。
2、在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
3、膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。
滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。
绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
结果分析：2、条带有时清晰，有时很散，不知为何？解答：可能原因：样品可能存在降解；转膜不及时造成扩散；转移缓冲液甲醇浓度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）。
3、背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡。
解答：这跟你washing的时间和强度有关，很可能你在这方面没有掌握好。
显影时间是有范围的，久了肯定不行。
杂带多的原因无非是几点：1、你的一抗如是多克隆抗体，可以试着降低一抗的浓度，如一抗是单抗，可适当降低二抗的浓度2、还有最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2小时室温封闭，时间允许可4度过夜封闭3、就是洗膜一定要充分我们一般PBST 10分钟三次，还有看你是DAB 显色吧，背景过深，DAB显色时间不要过长，一般2分钟足够。
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一．配胶
1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可
3．封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
二．样品处理
1．培养的细胞（定性）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP 管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：
⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液
（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
三．电泳
1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
四．转膜
1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。
干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。
PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。
将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。
注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。
将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。
降温，将电泳槽置于冰水混合物中。
恒流100mA过夜，或400mA，4h。
注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。
负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
五．封闭及杂交
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。
必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。
在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
六．发光鉴定
一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。
膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。
将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
七．增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
1．用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
2．将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
3．封闭40~60min
4．一抗杂交，室温1h。
37℃1h 会更强，但可能增加非特异条带。
5．PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
6．二抗杂交，37℃1h。
7．PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
8．发光鉴定。
9．若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10．三抗杂交，室温1h。
37℃1h 会更强，但可能增加非特异条带。
三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12．发光鉴定。
八．NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。
1．如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
2．如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip 液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
3．对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。