Western blot 实验技巧精要
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
westernblot精华
纯净水（ddH2O）
聚丙烯酰胺
（Arc-Bis） SDS
凝胶成份
Tris-HCL
四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯
酰胺的聚合）
过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基）
常用凝胶配臵比例
分离胶（12%） 浓缩胶（4%）
待瘤长至一定重量，处死裸鼠 称重，拍照 取出肿瘤 称重，拍照 保存于福尔马林中 液氮中冻存5min
保存于-80℃冰箱
MTT法筛选活性药物
取96孔板，每孔加100ul培养基
细胞悬液计数
每孔加约3000个细胞 孵育24h
加药
倍比稀释 法配药
加药
孵育72h
加MTT
570nm
ddH2O Arc-Bis
Tri-HCl 10%-SDS
4.95ml 6ml
3.75ml（PH=8.8） 150ul
3.05ml 0.67ml
1.25ml（PH=6.8） 50ul
10%-APS
TEMED
150ul
15ul
50ul
10ul
检漏 配分离胶，加水液封30min 待胶凝后，弃水，配积层胶，插梳子 胶凝后，加阴极液，拔梳子 上样（蛋白样品各10ml,Mark为2ml） 加阳极液，电泳
一抗、二抗孵育
封一抗，4 ℃时过夜。 加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动2h PBST洗膜2次，每次10min，PBS洗膜10min。
用底物发光法：将两种显色底物1：1等体 积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用 保鲜膜把膜包起来，马上在暗室中将X光片 覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡 量），显影、定影。 注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到 好处，过短会导致曝光不彻底， 影响条带亮度，过长会导致荧光信 号衰弱，也会使背景颜色加深。
western blot实验技术要点
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
Western blot（WB）实验技术要点
太和医院检验部
WB操作流程
样品处理
A
转印与封闭
C
蛋白检测
E
B
SDS-PAGE电泳
D
抗体孵育
失败！
理想的WB图片
1
2
3
背景干净 条带清晰
条带均一 间距相同
内参一致 差异突出
01 Part One 蛋白处理要点
蛋白处理至关重要
蛋白酶抑制剂
01
防
降
02
占据蛋白未结合位点 TBST溶解脱脂牛奶或BSA
室温1h或4℃过夜
04 Part Four
抗体孵育
抗体孵育
抗体稀释
孵育条件
注意事项
脱脂牛奶 BSA
抗体稀释液
室温1-2h
或 4℃过夜
抗体比例 充分洗涤 摇床速度
05 Part Five 蛋白检测
蛋白检测
01
显影剂孵育
均匀、快速滴加
02
曝光时间
避免过度曝光
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
western blot实验技术要点
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
E
转印时间控制
凝胶不能扭曲
B
C 正负极方向问题
D
气泡问题
封闭
封闭目的 封闭试剂 封闭条件
02 Part Two SDS-PAGE电泳
基本原理
低
高
电
电
压
压
A 浓缩
B 分离
低浓度胶
高浓度胶
A
电荷 量
B
分子 量
电泳技术要点
蛋白分子量
选择合适浓 度的分离胶
样品混匀 浓缩胶足够 目的带之间分开
上样要求 浓缩与分离
试剂的纯度 缓冲液 气泡
影响电泳的 因素
胶浓度的选择
凝胶浓度 6% 8% 10% 12% 15%
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
低温、快速操作
解
避免反复冻融
03
蛋白处理至关重要
保证浓度足够高
01
调
（细胞、裂解液的量）
浓
02
浓度测量要准
（混匀、稀释、复孔）
度
浓度调一致
03
最佳上样量经验总结
1.5mm玻璃板、10孔梳子，上样量：15-25μl 1.0mm玻璃板、10孔梳子，上样量：10-20μl 上样尽可能不超出每孔总体积的一半 内参10ug左右，即可清晰显出
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
Western blot步骤与经验总结
Western bloting经验总结1.试剂准备详细参考试剂配方2.制胶2.1 准备好制胶器，玻璃板务必要干净，否则容易产生气泡或使胶不平；玻璃板需卡紧，先用1ml H2O试探，以防漏胶。
将水倒去后用滤纸把残留在玻璃板上的水吸去（轻轻的，不要使卡紧的玻璃板松动）。
2.2 配胶：按需要配制适当浓度的胶，如上表及SDS-PAGE分离胶配方表。
充分混匀，尽量不要弄出气泡（可以轻轻快速旋转配胶用的烧杯30 s到1min，切莫太快以免液体溅出，如图所示[不是自转]；若用枪反复吹打，不要太快以免产生大量气泡）2.3 将胶慢慢加入到玻璃空隙中。
枪头可残留部分液体，以免把气泡打进玻璃板间，胶约7 ml（1.5mm厚，六一24D型）。
2.4 压胶：用无水乙醇或水轻轻地沿板加入，每块胶上加600 ul-1000 ul。
放于室温或37℃，务必放平，不平则胶歪，导致显出的蛋白条带歪曲。
2.4 20 min后倒去无水乙醇或水，用滤纸吸干。
（若胶不凝，可放30 min，再不凝的话就要考虑，10%AP溶液是否过期（有效一周）或浓度是否配错，是否忘记加促凝剂TEMED）。
2.5 配制浓缩胶(5%)并混匀，插好梳子，轻轻从梳子两端缝隙加入浓缩胶，直到胶快溢出梳子（溢出也无妨），检查是否有气泡，若有，将梳子轻轻拔出，重新插好。
放于室温或37℃，30分钟（浓缩胶较稀，时间要长些）3.冲洗加样孔：小心拔出梳子，若加样孔扭曲变形，可用针头将其扶正（勿将针头插到胶中）,先加部分1×SDS-PAGE 电泳缓冲液到内槽,用枪头吸电泳液轻轻冲洗加样孔，以排除气泡。
4.排除槽底的气泡：将内置电泳槽放在外槽中，加入1×SDS-PAGE 电泳缓冲液（外槽液，可以是内槽回收液）溢过底部胶（液面离底部3-4cm即可），倾斜整个电泳槽，反复提起放下内电泳槽，直至完全排除内槽底的气泡。
5.上样：蛋白样本与一定比例的上样buffer（5×）4:1混匀，沸煮3-5分钟。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm 微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
WesternBlot实验实用技术手册总结
Western Blot 实验技术手册Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。
目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一 .一、 Western Blot 基本操作流程图细胞 / 组织蛋白提取↓ 蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二. Western Blot 操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB 结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。
使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净 PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心 12,000 rpm ，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80 °C，每约 5 mg 加入约 300 μl预冷的裂解液lysis buffer ，冰浴匀浆后置于4℃摇动 2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml,理想的蛋白浓度应为 1-5 mg/ml). ，4℃离心 12,000 rpm ， 20 min ，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford 法、和 Lorry 法或 BCA 法，一般推荐用 BCA 法 .BCA 测定方法如下:A ．酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号 1 2 3 4 5 6 7 8蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.02、根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3、各孔加入 200 μ L BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。
Western blot 实验技巧精要
Western blot 实验技巧精要Western blot 方法在SCI 文章中出现的频率非常高，漂亮的WB 电泳图可以给文章增色不少。
但是WB 实验的步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。
一、样品准备部分我们不应该太过重视WB 电泳部分的操作技巧，样品准备才是整个WB 实验中最重要的一个环节（没有之一）。
否则WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。
小编认为以下3 点值得大家重点关注：1. 注意孵育、终止时间如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕1 秒也不要提前或耽搁。
2. 抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。
抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：(1) 使用蛋白酶抑制剂罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂Cocktail 片剂，效果不错。
再与PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。
(2) 全程低温操作提前预冷PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。
除了使用冰盒，大多数操作都是在4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。
3. 裂解液用量将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。
裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。
如果加入的裂解液不足，蛋白浓度太高，会造成与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好。
做磷酸化蛋白检测时为了在每个胶孔中尽可能多上样，所以用体积较少的裂解液制备了浓度很高的蛋白，结果就得不偿失了（见下图）。
这种情况的补救方法是给样品继续补加上样缓冲液，煮样，再跑胶。
直接给已经煮过样的样品补加上样缓冲液再煮样，跑胶后的效果也会好很多（见下图）。
如果加入的裂解液过多，蛋白浓度太低，会导致在胶孔中的上样量不足，条带不清晰。
Western blot 实验技术
（2） 检测样品蛋白含量
1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。 室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可 做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测 空白样品。
注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一
个孔大约上100ug的总蛋白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 后,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之 蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就 只剩下分子大小一项因素。
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6、 测完蛋白含量后，计算含20-50μ蛋白（根据自己的实验需要进行 选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl 的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×（上样总体积一般不 超过15μl，加样孔的最大限度可加20μ样品）上样前要将样品于沸水 中煮5-10min使蛋白变性。
封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
Western Blot快速实验攻略概要
Western Blot 快速实验攻略一、 Western Blot 实验原理蛋白免疫印迹(Western Blot , WB 是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。
完整的 WB 流程,如下图所示,包含样本制备、 SDS-PAGE 、转膜、抗体结合、蛋白检测等 5个大步骤。
二、试剂准备1. 各类缓冲液1电泳缓冲液:10xTris-Glycine-SDS 电泳缓冲液(20319ES76 2电转缓冲液:Western Blot 电泳电转通用缓冲液(20329ES03 3蛋白上样缓冲液:5Xsds-PAGE 蛋白上样缓冲液(20315ES05 4其他缓冲液:PBS , TBST 2. 样本制备1细胞裂解液:RIPA (20101ES60,或 20115ES60,或 20114ES60 2蛋白酶抑制剂:PMSF (20104ES03 3. 蛋白定量1蛋白定量试剂:BCA 蛋白定量试剂盒(20201ES76 4. 蛋白电泳1预制胶:4-20%梯度预制胶, 12孔(36214ES102蛋白 marker :三色预染蛋白分子标准(10-245kDa (20352ES76 5. 转膜与封闭 1膜(自备2膜上蛋白检测:丽春红染色液(36221ES60 3膜的封闭:BSA ,无 IgG (36103ES256. 抗体孵育1抗体:内参抗体、一抗、二抗(例:30101ES10, 30401ES10, 34101ES602检测试剂:ECL 化学发光超敏显色试剂盒(36208ES60三、实验步骤1. 样本制备1融解 RIPA 裂解液,混匀。
取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入 PMSF ,使 PMSF 的最终浓度为 1mM 。
2贴壁细胞:去除培养液,用 PBS 、生理盐水或无血清培养液洗一遍。
按照 6孔板每孔加入 150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。
细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。
Western-Blot-原理和操作方法(全)要点
Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
我的western-blot实验经验总结
我的western-blot实验经验总结
Western-blot实验是一种常用的免疫学分析方法，用于检测蛋白质的存在、定量和分子量。
在进行这项实验时，需要经过以下几个步骤：
1. 样品制备：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其分离成不同的组分。
这可以通过各种方法来完成，例如细胞裂解、电泳分离等。
2. 凝胶制备：将分离的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳分离蛋白质，使其根据分子大小以不同的速度移动。
3. 转移：将凝胶中分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺或聚偏氟乙烯膜上，以便进行进一步的免疫学分析。
4. 免疫学反应：使用特定的抗体识别目标蛋白质，并进行免疫学检测。
这包括将蛋白质与一种或多种特定抗体反应，再使用荧光标记或酶标记的二抗进行检测。
5. 成像和数据分析：使用特定的成像方法，例如荧光显微镜或化学发光成像，来可视化免疫学反应结果。
然后进行数据分析，例如测量蛋白质的强度、定量分析等。
在进行Western-blot实验时，需要注意一些常见问题，例如蛋白质分离不完全、
抗体不充分、背景噪音等。
为了获得准确和可重复的结果，需要仔细控制实验条件、进行质量控制和标准化操作。
自己根据实验总结的Western blot
Western blot一、试剂配制1）细胞裂解液：用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。
2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。
PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。
pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。
4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。
5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。
6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。
注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。
8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。
9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。
最新Western-Blot-操作要点
W e s t e r n-B l o t-操作要点Content 1.Objective2.Scope3.Materials➢Reagents➢Instrument➢Consumable4.Procedure5.Changing history1．Objective －鉴定蛋白表达情况－2. Scope －－本SOP适用于 Western-Blot试验操作3．Procedure 仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、12％分离胶、5％浓缩校、2XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、一抗（由委托人提供）、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗兔二抗、ECL化学发光试剂、显影液、定影液。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；PVDF膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（APS）过硫酸胺0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
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Western blot 实验技巧精要
Western blot 方法在SCI 文章中出现的频率非常高，漂亮的WB 电泳图可以给文章增色不少。
但是WB 实验的步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。
一、样品准备部分
我们不应该太过重视WB 电泳部分的操作技巧，样品准备才是整个WB 实验中最重要的一个环节（没有之一）。
否则WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。
小编认为以下3 点值得大家重点关注：
1. 注意孵育、终止时间
如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕1 秒也不要提前或耽搁。
2. 抑制蛋白降解
这是样品制备中最需要注意的部分。
抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：
(1) 使用蛋白酶抑制剂
罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂Cocktail 片剂，效果不错。
再与PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。
(2) 全程低温操作
提前预冷PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。
除了使用冰盒，大多数操作都是在4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。
3. 裂解液用量
将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。
裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。
如果加入的裂解液不足，蛋白浓度太高，会造成与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好。
做磷酸化蛋白检测时为了在每个胶孔中尽可能多上样，所以用体积较少的裂解液制备了浓度很高的蛋白，结果就得不偿失了（见下图）。
这种情况的补救方法是给样品继续补加上样缓冲液，煮样，再跑胶。
直接给已经煮过样的样品补加上样缓冲液再煮样，跑胶后的效果也会好很多（见下图）。
如果加入的裂解液过多，蛋白浓度太低，会导致在胶孔中的上样量不足，条带不清晰。
那么加入多少体积的裂解液最好呢？小编认为，加入细胞团体积的10 倍体积的裂解液是一个比较好配比，当然也可以根据目标蛋白进行调整。
二、WB 电泳部分
得到了高质量的样品就已经很接近成功了，小编接下来为大家介绍一些WB电泳部分的注意事项。
1. 制胶
如果自己配置母液，就请注意pH 值。
制胶部分最重要的是在配浓缩胶前不要着急将分离胶上面的水弃掉，先配好浓缩胶，在加TEMED 之前再弃掉水。
小编虽然没有亲自试过，但是如果弃掉水后5 分钟之内还没有加上浓缩胶，这块胶最好还是不要用了。
2. 上样
小编的经验是上样的总蛋白量一般是20-70ug，这个要根据检测蛋白的含量而定，需要摸索。
计算后每个样品的上样体积如果比较小，用枪头直接上样是完全可以的，如果上样量超过20ul，最好还是用微量注射器来上样。
上样确实是需要多多练习和体会的，上样技术高可以多上10ul 样品而不溢出。
如果需要上样的体积太大，也可以先上一部分，然后跑几分钟电泳，再停下来继续上样，这是完全可以的，经过下一步的调整，是不会影响效果的。
3. 电泳
每个孔的上样量参差不齐没关系，在样品还没有达到分离胶时用≤60V 的电压可以很好的将样品排列整齐，不容易跑出弧线或者不齐的线。
当样品达到分离胶后，通常会改成100V 继续电泳，小编认为如果时间充足，电压低一点效果不错。
注意：电压改一次就好，不要多次调整。
4. 转膜
转膜环节最重要的，也是最容易被大家忽视的一步是：预冷电转液。
大家一定感觉到过，电转液加入甲醇后温度会迅速上升，所以建议跑上电泳就配电转液，加入甲醇后放入4℃冰箱预冷。
当然，也不要忘了赶气泡，赶气泡时方向不要太随意，也不要太用力，否则可能会使胶变形，尤其是边缘部分，然后你的条带就会……比较有艺术感了……（见下图）
最后别忘了膜需要先在甲醇中浸泡一下，然后在电转液中洗一洗再使用。
5. 封闭、一抗、二抗
很多WB 技巧介绍都会根据曝光后的电泳图的效果指出需要降低或提高一抗的稀释倍数，延长或减少二抗孵育时间等等。
只要按照说明书上推荐的比例做就没有问题。
出现各种条带不好的情况，更大的可能是前面步骤中出现了问题，而不是这一步。
如果是用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，建议大家在放入膜后，将杂交袋中的TBS-T 赶出来，然后再加入一抗或二抗，这样一抗和二抗就不会被膜上残留的TBS-T 稀释了。
6. 曝光
当电泳图上的条带不够好时，曝光相关参数也是经常被认为是需要调整的部分。
曝光不是关键的步骤，前面做好了，曝光是很简单的。
小编用的是ECL 发光液曝光法。
这种方法最需要注意的就是ECL 要在条带上分布均匀。
小编用的是普通自封袋，将膜放在一片自封袋上，加上发光液后，再盖上一片自封袋，用手指赶一下，发光液就会比较均匀，效果不错。