WB工艺注意事项
WB原理及操作注意事项详解解读
• 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而 后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维 素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后 人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分 析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对 单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹 法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分 子的印迹分析称为Eastern印迹法。
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly
WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。
这会直接影响到样品浓缩的效果。
此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。
因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。
wb注意事项
1.配胶用的AP要新鲜，最好现用现配。
方法是0.1g过硫酸铵，加1ml水。
2.用异丙醇压平胶面之后要用清水洗几次，确保没有大量异丙醇残留。
建议用水压面。
3.要调整TEMED用量，防止胶凝得过快，凝的过快不利于凝胶均匀聚合。
配置的胶必须混合均匀。
4.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE 的分离胶(即下层胶)。
SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围:6%胶 57-212kD8%胶 36-94kD10%胶 20-80kD12%胶 12-60kD15%胶 10-43kD5.如果浓缩胶跑的好的话，几个孔的蛋白会跑成一条直线。
注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液6.电泳结束时候蛋白条带会扩散，防治扩散的溶液是：40%无离子水 10%乙酸 50%甲醇，即40ml蒸馏水，10ml乙酸，50ml甲醇。
7.转膜：滤纸不要过大，防止形成短路。
8.PVDF膜先用甲醇泡几分钟，目的是为了增强膜的正电荷。
甲醇泡完后，得在转移缓冲液里泡一两分钟。
9.A ll proteins are hindered from binding to membranes bySDS but small proteins more so than large proteins. If your protein of interest is small, consider removing SDS from the transfer buffer.10.对于小分子量蛋白(<100 kD)SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。
如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。
保持甲醇的浓度在20%一般在转大分子量蛋白时电转液里加入0.1%SDS 是为了增加转印效率，在转小分子时可以不用；另外，转小分子时电转液里的甲醇浓度最好提高到15-20%。
WB注意这些问题，新手也能做出满意结果
WB注意这些问题，新手也能做出满意结果Western Bolt实用小细节Western blot（WB）是检测蛋白质及蛋白质翻译后修饰的经典方法，可在简单或复杂的生物样品中提供有关靶蛋白的半定量或定量数据。
WB步骤复杂，通常包括：蛋白样本制备→电泳→转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→显影→分析。
WB任何过程出现Bug均可影响结果的重复性与灵敏度，因此必须注意将WB的每个步骤标准化。
今天给大家分享WB各个过程中需要注意的细节！1样品制备有效的样品制备是影响WB可重复性的非常重要的因素。
需考虑以下问题：1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白，细胞质/膜蛋白？2、溶解的蛋白或其翻译后修饰的维持是否需要添加额外的缓冲成分(例如洗涤剂、酶抑制剂)？3、蛋白质定量的方法是什么，缓冲成分会干扰蛋白定量吗？BCA 蛋白定量检测法是总蛋白质定量的常用方法，其蛋白间差异较考马斯染料法的更小，但与还原剂、螯合剂不兼容（兼容去垢剂）。
2电泳1、最合适的凝胶浓度是什么？不同分子量的蛋白分离胶浓度对应表：2、哪种电泳缓冲液最合适？例如，3-(N-吗啡啉）丙磺酸缓冲液（MOPS缓冲液）适合~75KDa的蛋白质，2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)适合<36KDa的蛋白质。
3、电泳多长时间和以及电泳条件？4、蛋白质的分子量迁移情况如何？蛋白质的分子量迁移因凝胶类型、浓度和电泳缓冲液的不同而不同。
对应情况如下：3转膜1、什么是最合适的膜？例如，PVDF膜或NC膜（0.45μm）。
PVDF膜有两种规格，0.45μm的膜适用于检测大于20KDa的蛋白质，0.2μm膜适用于小于20的蛋白质。
PVDF需要在甲醇中浸泡1-2min 激活。
不同分子量蛋白转膜条件：大于150KDa蛋白可恒压20V 4度湿转过夜。
2、转膜液甲醇浓度如何？小分子量蛋白的转膜需要注意：（1）高浓度的凝胶有利于小分子量蛋白的分离。
一般在目的蛋白离凝胶前沿0.5-1cm时停止电泳，太靠近凝胶前沿易引起边缘效应。
Western Blot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。
这会直接影响到样品浓缩的效果。
此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。
因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。
因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。
大分子量蛋白 western注意事项
大分子量蛋白 western注意事项在进行大分子量蛋白 Western 检测时，需要注意以下几点：1. 蛋白提取：确保使用适当的蛋白提取方法，以获得高质量的蛋白质样品。
对于大分子量蛋白，可能需要使用更剧烈的裂解条件或添加蛋白酶抑制剂来防止蛋白降解。
2. 电泳条件：选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以确保大分子量蛋白能够有效分离。
通常，使用较低的凝胶浓度可以更好地分离大分子量蛋白。
3. 转膜：选择合适的转膜方法和条件，以确保大分子量蛋白能够成功转移到膜上。
常用的转膜方法包括半干转印和湿转印，对于大分子量蛋白，可能需要延长转膜时间或使用低分子量滤纸来增加转移效率。
4. 封闭：选择适当的封闭液和封闭时间，以减少非特异性结合。
对于大分子量蛋白，可能需要使用更长的封闭时间或更浓稠的封闭液来减少背景。
5. 抗体选择：选择针对大分子量蛋白的特异性抗体，并确保抗体的质量和特异性。
对于大分子量蛋白，可能需要使用更高质量的抗体或进行抗体浓度的优化。
6. 检测方法：根据抗体的特性选择合适的检测方法，如化学发光、荧光或显色法。
对于大分子量蛋白，可能需要使用更敏感的检测方法来确保检测的准确性。
7. 膜的处理：在孵育抗体和检测之前，确保膜的充分洗涤，以去除未结合的抗体和杂质。
对于大分子量蛋白，可能需要增加洗涤次数或使用更严格的洗涤条件。
8. 数据分析：在分析 Western 结果时，要考虑到大分子量蛋白可能存在的多态性、截断或降解等因素。
对于异常结果，要进行适当的验证和排除。
总之，对于大分子量蛋白的 Western 检测，需要特别注意蛋白提取、电泳、转膜、封闭、抗体选择、检测方法和膜的处理等方面，以确保获得准确可靠的结果。
小分子 蛋白wb注意事项
小分子蛋白wb注意事项以小分子蛋白WB注意事项为标题，我们来讨论一下在进行小分子蛋白Western Blot（简称WB）实验时需要注意的事项。
一、实验前的准备工作在进行小分子蛋白WB实验之前，我们需要做一些准备工作，以确保实验的顺利进行。
首先，我们需要准备好实验所需的试剂和仪器设备。
这包括蛋白提取液、蛋白浓度检测试剂盒、凝胶电泳设备、转移膜等。
同时，我们还需要准备好实验所需的动物组织样本或细胞培养物。
二、蛋白提取与浓度检测在进行小分子蛋白WB实验之前，我们需要从组织样本或细胞中提取蛋白。
蛋白提取的方法有多种，如RIPA缓冲液法、细胞裂解液法等。
提取蛋白后，我们需要使用蛋白浓度检测试剂盒来确定蛋白的浓度，以便后续的凝胶电泳和转膜步骤。
三、凝胶电泳凝胶电泳是分离蛋白的常用方法，可以根据蛋白的大小和电荷来进行分离。
在进行凝胶电泳时，我们需要根据实验的需要选择合适的凝胶类型和浓度。
同时，我们还需要准备好电泳缓冲液，并根据实验的需求进行电泳条件的设置。
四、转膜转膜是将凝胶中分离的蛋白转移到转移膜上的过程。
在进行转膜之前，我们需要准备好转膜装置，并将其装配好。
在进行转膜时，我们需要注意转膜膜的选择，如聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）。
转膜的条件也需要根据实验的需求进行设置。
五、免疫检测在进行小分子蛋白WB实验时，我们通常会使用特异性抗体来检测目标蛋白。
在进行免疫检测之前，我们需要对抗体进行充分的验证，确保其具有良好的特异性和敏感性。
在进行免疫检测时，我们需要根据实验的需求进行合适的抗体稀释，并按照标准的免疫检测步骤进行操作。
六、结果分析在完成小分子蛋白WB实验后，我们需要对实验结果进行分析。
这包括对目标蛋白的表达水平进行定量分析，并与对照组进行比较。
同时，我们还可以进行进一步的数据统计和图像处理，以获得更准确的实验结果。
进行小分子蛋白WB实验时需要注意的事项包括实验前的准备工作、蛋白提取与浓度检测、凝胶电泳、转膜、免疫检测以及结果分析。
W-B注意事项
1．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳注意胶有剧毒（神经毒性）！！必须带手套，注意自身安全问题！！！在该实验室操作时，没带手套不要碰任何东西！！制胶模具的准备（根据厂家说明书）注意每次用完后要用洗洁精洗净，用水冲干净，模具上的脏物及洗洁精残留的SDS均会影响胶的凝固过程，影响胶的均匀性分别灌制分离胶和浓缩胶，分离胶浓度视目的蛋白的大小确定（7.5%～15 %）具体见试剂配方（分别试了12％及12.5％的分离胶两种浓度，推荐浓度为12.5％的分离胶），分离胶上样(注意是否有漏)、水封（速度要慢，防止稀释，要有枪头由一侧滑动至另一侧的动作）、静置半小时，将封闭用的水去除（剩余的水用滤纸吸干净），配浓缩胶，上梳，静置半小时，拔梳（小心，在running buffer中进行，速度要慢）观察梳形是否整齐。
蛋白样本（加蛋白样本的量根据实验所需）加入4×加样缓冲液（见配方）及水，100°C 煮5 min使蛋白完全变性，例：跑胶每个样本20ul（我们加样感觉加20ul会溢出，实验时选择加16ul），需含蛋白量80ug，80/蛋白浓度得到需要蛋白样本加样量X。
加样缓冲液（4×sample buffer）加5ul，20－5－X即为加水量。
煮沸时注意管口要封劳。
如果有条件的话用封口膜。
煮沸以后用离心机低速离心20秒左右，上样时要看清梳形，小心加样，防止交叉污染，100 V电泳30min浓缩胶，150V电泳70min分离卸胶，把你所要的部分切下来，注意在胶的长度方面宁可多切，结果分析时需要完整的条带补充：（1）在浓缩胶内先用100V电压跑胶，再用200V可以使条带更直；（2）在使用4×加样缓冲液时如天气较冷，应先用37°C水浴使其中的SDS溶解；（3）第一次使用剩下的蛋白样本在－20℃冰箱保存。
在第二次使用稀释好的蛋白样本时应同样用100°C水煮；（4）加样时每块胶应有Mark和对照，并保持对照的始终一致。
WB注意事项
WB注意事项
1.制胶时，长短板下端对齐，以免漏胶，可以先用水进行检漏
2.制胶时，需根据蛋白分子大小配制分离胶，因此需要提前确定蛋白分子大小
3.制备样品时，样品需95 度灭活，maker 不需要
4.上样时，尽量做到快、准、稳，小心样品弥散
5.上样时，如有多余的孔，则加入与样品等量的上样缓冲液
6.跑电泳时，注意观察底部是否有气泡上升，如未发现气泡，则检查装置安装是否有误
7.转膜前，需提前制冰，转膜液需提前预冷
8.转膜时，注意膜与胶的摆放位置与顺序，放好后赶出气泡
9.转膜结束时，根据蛋白分子大小对膜进行剪裁，注意在膜的正面做标记
10.孵育抗体时，一抗可以重复使用4-5次，每次用完注意回收，二抗现配现用，不可重复使用
11.显影时，需将放置膜的板子擦拭干净，有条件可覆盖一层保鲜膜，然后再将膜放上去，滴加显影液。
wb实验流程及注意事项
wb实验流程及注意事项
WB实验是一种常见的免疫学实验，其流程大致如下：
1.制备细胞悬液：将需要研究的细胞通过离心、洗涤等操作制成含有约1×10^6个/ml的单细胞悬液。
2.孵育细胞：将细胞悬液加入含有10%腹水的RPMI1640培养基中（也可添加适量的FBS）进行孵育，通常孵育时间为24-48小时。
3.收获细胞：将孵育后的细胞通过离心等方式收获，以备进行下一步操作。
4.制备干标准物：将抗体或其他试剂制成干标准物（包括一系列浓度档次），通常冷冻保存备用。
5.制备稀释液：将PBS或其他缓冲液配成不同浓度的稀释液，可用于对干标准物的稀释。
6.加入样品：将步骤3中的细胞悬液加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
7.加入干标准物：将制备好的干标准物加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
8.孵育：将加入样品和干标准物的96孔板进行孵育，通常为2-3小时，使细胞与抗体结合。
9.洗涤：用PBS或其他缓冲液进行洗涤，去除未结合的试剂。
10.加入二抗：加入与干标准物匹配的二抗，并进行孵育。
经过一定时间，细胞与试剂结合形成免疫复合物。
11.用底物发光：加入底物，进行化学发光反应，根据发光量推算出样品中对应物质的浓度。
注意事项：
1.所有试验所用材料要保持洁净，尤其是培养皿和吸管，以避免污染。
2.在制备稀释液和样品时要准确称量，避免误差，同时要注意样品的体积和浓度，保证实验的可靠性。
3.在操作过程中，要规范操作流程，严格遵守实验规程，注意自身安全。
4.试剂保存要避免高温和阳光照射，同时要注意过期时间。
5.实验过程中要及时记录数据，以便后续分析。
wb蛋白提取注意事项
wb蛋白提取注意事项
嘿呀！以下就是关于wb 蛋白提取的注意事项啦！
1. 哇，首先得保证实验环境的干净整洁呢！不能有灰尘啥的，要不然会影响蛋白提取的纯度呀！
2. 哎呀呀，选择合适的细胞或组织样本可太重要啦！这直接关系到后续的提取效果哟！
3. 提取试剂的质量得严格把关呢！要是试剂不好，那可就糟糕啦！
4. 操作过程中一定要轻柔呀，别把细胞弄破了，不然蛋白都跑掉啦！
5. 温度的控制也得留意呢！过高或过低的温度都可能导致蛋白变性呀！
6. 嘿，提取的时间得把握好，时间太长或太短都不行哦！
7. 离心的速度和时间要设置准确呀，这可不能马虎！
8. 蛋白提取后要尽快进行后续处理，别放太久啦！
9. 哇塞，实验器具一定要消毒干净，不能有杂质残留哟！
10. 提取过程中要做好记录呢，这样出了问题能及时找到原因呀！
11. 哎呀呀，注意个人的防护措施，别让试剂伤到自己啦！
12. 不同样本的处理方式可能有差异，要区别对待呢！
13. 蛋白提取的步骤要严格按照操作指南来，不能随意更改呀！
14. 哇，试剂的添加顺序可不能错，错了就麻烦大啦！
15. 实验过程中要随时观察样本的状态，有异常得赶紧处理哟！
16. 哎呀，提取的蛋白要妥善保存，防止降解呢！
17. 嘿，要确保所有的仪器都校准准确，不然数据就不准啦！
18. 注意提取过程中的无菌操作，防止细菌污染呀！
19. 哇哦，提取的蛋白要进行质量检测，保证能用哟！
20. 最后呀，多总结经验，不断提高提取的成功率呢！
哎呀呀，这些注意事项可都很关键哟，大家一定要记住啦！。
wb操作注意事项
一．配胶1．注意要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于玻板架上。
2．除AP及TEMED外，分离胶及浓缩胶按照说明书配好，存放于室温，灌胶前加入10%AP 及TEMED，轻轻混匀，不要产生气泡。
3．封胶：灌入2/3的分离胶后立即用无水乙醇封胶。
封胶后不要移动胶架。
40分钟后，待胶凝后可见一清晰的分界线，将乙醇倒掉，用滤纸条吸取残留乙醇。
4．灌好浓缩胶后立即插入梳子，1h后再上样。
二．电泳1．上样前玻板内外加满电泳液后再拔除梳子，排出胶板下的气泡赶走。
2．提前将所有蛋白样品调至等体积等浓度，Marker用1×loading buffer和RIPA调整至与样品等体积（marker 3微升，1×loading buffer2微升，其余用RIPA补齐）。
2．浓缩胶用70V的电压电泳，达到分离胶时改为120V。
3．在溴酚蓝泳动至距胶下缘1cm时结束。
三．转膜1．电泳结束前20分钟左右准备电泳液（100ml甲醇，100ml 10X电泳液，800ml水）。
用甲醇浸泡剪好的PVDF膜2min，随后浸泡入前次回收的电转液中进行平衡。
2．取胶：将胶卸下，撬开短玻板，将需要分子量的条带切下，在转膜夹黑色一侧按顺序铺上黑海绵、滤纸，胶、膜，每铺一层赶一次气泡。
在铺一层滤纸，白色海绵。
合上转膜夹。
3．转膜：转膜夹放入电转槽，注意黑对黑。
放入冰袋降温，加入新配的电转液。
恒流300mA 2h。
四．封闭及杂交1．封闭：将膜从电转槽中取出，用TBST稍加漂洗，浸没于5%脱脂牛奶中封闭，缓慢摇荡一小时。
回收牛奶，10minX3次。
2．结合一抗：内参和目的蛋白一抗1:5000稀释。
以接触胶的一面为正面，背靠背放入封口袋内。
4℃摇床过夜（约12-14小时）。
3．洗涤：一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次，每次10min。
4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，用HRP标记的抗体，1:5000稀释，室温轻摇一小时。
WB的原理、操作及注意事项
WB的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展。
膜蛋白wb注意事项
膜蛋白wb注意事项
1. 嘿，可别小瞧了样本处理这一步呀！就像盖房子打地基一样重要呢！比如你要测某种膜蛋白，样本处理不好，那后面不就全白费啦！一定要细心再细心哦！
2. 抗体选择可不能马虎呀！这就好比挑鞋子，得合脚才行呢！要是选错了抗体，那不就像穿着不合脚的鞋跑步，能舒服吗？能出好结果吗？
3. 跑胶的时候可得稳住呀！这就跟开车似的，得稳稳当当的。
要是跑得乱七八糟，那后面还怎么分析呀，你说是不是？
4. 转膜也要注意哦！这可是关键的一环，就好像传球一样，得准确无误地传到下一个环节，不然结果可就大打折扣啦！比如转膜不完全，那不就糟糕啦！
5. 封闭不能随便搞哦！这就像给膜蛋白穿个保护衣，要是没穿好，后面那些杂信号不就都来了。
你想想，这多闹心呀！
6. 洗膜也很重要呀，可别不当回事！这就好像给膜洗澡，得洗干净呀，不然残留的东西不就捣乱啦！你见过没洗干净的后果吧，那可太烦人啦！
7. 孵育抗体要耐心哦！就跟等花开一样，急不得呀。
要是没等够时间或者温度不对，那效果能好吗？你快想想呀！
8. 显色的时候可得瞪大眼呀！这是见证奇迹的时刻啦，但也得小心别出错哦。
要是不小心搞砸了，那不就白忙乎啦！
我的观点结论就是：膜蛋白 wb 每一个步骤都至关重要，任何一个小细节都不能忽视，一定要认真对待呀！。
WB的原理操作及注意事项
WB的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
wb注意事项
Western blot 注意事项1.当进行接触滤纸、凝胶和膜的操作时，应戴手套。
手上的油脂会阻断转移2提蛋白一定要过硬，不能吝惜蛋白酶抑制剂3测定蛋白浓度一定要选好方法4. 最重要的，wb的成功最大程度的依赖于sds-page5．最好有预染marker6．底物显色的这一步也非常关键7.蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）常见问题：1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平? 1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。
3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。
4) 稍微注意手法，均匀加入。
5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。
6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。
7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。
2、胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。
2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。
3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。
4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。
5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。
（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。
WB过程中常见问题及处理方法
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数； 3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应
——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化
c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤 +海绵+阳极碳板，不能放反
d转膜过程产生大量的热，注意冷却
e具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定； 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间 越长，反之则短
f避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手 上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜 脏掉。
5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数，增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
• 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二 抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。 可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性
• 更换更好的一抗二抗
2、一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度； 长孵育时间；
2、制胶 根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净， 不能有残留的胶。 玻璃板底部放平，尽量不能漏胶 灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝 水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜
a 泡膜：
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转 移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶 皱缩，导致出现转移条带变形
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我以前是搞wire bond的，单从专业方面说，我觉得你应该总结一下你学到的东西，不知道你是偏重硬件方面还是软件参数方面。
1. 如果是硬件：设备型号，焊线精度，焊线速度，工作最大尺寸，PR及焊线系统控制，每个控制板控制什么等等。
2. 如果是软件: 焊线方式（BBOS、BSOB与Stich bond），系统升级，为新型号编写程序，参数设置（power，force，time；standby、contact和bond三个阶段有何不同），还有一些辅助功能。
3. 其他方面：金线或铝线的线径，焊点的直径，两焊点的间距，瓷嘴的尺寸（CA、ICA、H等等），如何选择瓷嘴或如何确定瓷嘴的尺寸。