流感病毒实验室检测
流感的相关知识及实验室检测内容详析
因此对于高危人群，应在发病后尽早采 样，必要时可采用多部位、多次取样检 测,以提高流感病毒阳性检出率
参考文献
参考材料
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李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC
检测方法的选择
有研究对流感病毒胶体金抗原快速检测法与核酸 PCR 法比较， 两者之间一致性较差。以咽拭子流感病毒核酸检测为标准， 流感病毒抗原快速检测法（胶体金法）的敏感性和特异性分 别为 27.6% 和 86.9%，其敏感性明显低于国内外文献报道的 水平（40%-85%）；
MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞 进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度
原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并 识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动 物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其 结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血 凝素结合后，可以抑制凝集现象出现
待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准 参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判 定为此型别的流感病毒
参考材料
31
4 实验室检测的相关影响因素分析
参考材料
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约60%-70%不准确的检验结果产生于分析前阶段
做好分析前的质量控制是保证检 测结果准确可靠的先决条件
影响流感病毒检测的因素也大多出现在分析前
参李考珺文，献刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[参J].考国材际病料毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC
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标本采集时间的选择
从标本采集时间上分析，有文献报道，发病后 2d 就诊的流 感样病例，流感病毒阳性检出率明显高于其他各组，发热4 天后就诊患者流感病毒阳性检出率最低，随着病程的延长， 咽拭子病毒核酸的检出率呈下降趋势
甲型流感的分子诊断技术与实验室检测方法
甲型流感的分子诊断技术与实验室检测方法甲型流感是一种由甲型流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其传播迅速且易感染大量人群。
为了准确诊断和及时干预，科学家们开发出了多种分子诊断技术和实验室检测方法。
本文将介绍几种常用的技术与方法，以提高对甲型流感的检测效率和诊断准确性。
一、聚合酶链式反应（PCR）技术PCR技术是一种灵敏度高、特异性强的分子诊断技术，已被广泛应用于甲型流感的检测中。
该技术通过放大甲型流感病毒基因组中特定的DNA片段，从而使其能够被检测到。
PCR技术可在短时间内，从患者的样本中检测到甲型流感病毒的存在，并确定其亚型。
此外，PCR 技术还能够对病毒的基因组进行序列分析，从而确定其突变情况和传播途径。
二、实时荧光定量PCR（qPCR）技术实时荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进版本，其主要优势在于可实现对病毒数量的精确测量和即时定量。
该技术结合了PCR和荧光探针技术，使得可以在PCR反应过程中实时监测目标序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR技术能够快速检测出甲型流感病毒的数量，并对病毒载量进行准确测量，帮助医生判断病情的严重程度，指导治疗决策。
三、免疫荧光技术免疫荧光技术是一种通过特定的抗体和荧光探针对病毒进行检测的技术。
在甲型流感的实验室检测中，科学家们通常采用免疫荧光技术检测病毒的抗原。
该技术的原理是将含有甲型流感病毒的标本与特异性荧光标记的抗体结合，然后通过荧光显微镜观察是否有荧光信号出现。
免疫荧光技术能够准确、快速地检测出甲型流感病毒的存在，并且可以对其亚型进行鉴定。
四、核酸测序技术核酸测序技术是一种可以解析病毒基因组序列的方法，可以帮助科学家们了解甲型流感病毒的基因组结构和功能。
通过高通量测序技术，科学家们可以在较短的时间内获取大量的病毒基因组序列信息。
这些信息有助于了解甲型流感病毒的变异情况，筛选药物治疗靶点，并指导疫苗的设计与开发。
五、免疫学检测方法除了分子诊断技术，免疫学检测方法也发挥着重要作用。
流感病毒实验室检测流程
1
流感病毒实验室检测流程
流感病毒实验室检测流程简述如下：
→样本采集：采集患者咽拭子、鼻咽拭子或呼吸道分泌物
→标本处理：使用病毒保存液，保持样本活性，低温运送
→实验室接收：记录信息，安全条件下接收样本
→核酸提取：从样本中提取RNA
→RT-PCR检测：逆转录聚合酶链反应，检测流感病毒核酸
→结果分析：观察PCR产物，判断阴阳性
→病毒分离培养：必要时，于生物安全柜中进行鸡胚或细胞培养→病毒鉴定：通过HA试验、基因测序等确定病毒类型和亚型→出具报告：记录检测结果，及时报告给临床医生
→生物安全：全程严格遵守生物安全操作规程。
1。
流感病毒实验室检测方法的对比分析
薛文仲, 张斌, 王中强, et al. 流感病毒的检测和分型技术研究进展[J]. 生 物技术通讯, 2011, 22(4):559-563. 流行性感冒诊疗方案（2018年版）[J]. 中国感染控制杂志, 2018. 田燕, 梁洁, 陆志刚. 流感病毒不同检测方法的探讨[J]. 现代预防医学, 2013, 40(20):130-130.
检测结果判读
核酸检测阳性：结合症状确诊流感病毒感染。 抗原检测阳性结果：结合症状临床诊断病毒感染。 抗原检测阴性结果：不能完全排除流感病毒感染。 假阴性：①病毒含量低；②靶表位区氨基酸的微小改变都可能造成单克 隆抗体不能检测或检测敏感性下降；③受稀释比例、结果判读时间长短 以及主观判断结果等不确定的因素影响。 建议核酸检测：抗原阳性但无症状，有症状但抗原阴性。 用药后症状消失抗原阳性。
流感病毒实验室pcr检测技术
流感病毒实验室pcr检测技术
第21页
Real-Time PCR
▪ 基础原理:指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程,最 终经过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析 方法.荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR 荧光染料
标本采集（一）
▪ 主要采集上呼吸道标本 ▪ 鼻咽拭子：将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几
秒吸收分泌物。 ▪ 口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃体部位，防止触及
舌部；快速将棉签放入无菌、内装3-5ml样本运 输液及带垫圈螺口塑料管中，在靠近顶端处折断， 旋紧管盖并密封。 ▪ 气管分泌液：搜集气管吸收液或支气管浇灌液510ml放入无菌、带垫圈50ml螺口塑料管中，马上 密封。
区、旅游区）人群健康，快速诊疗将提供有效信息以 供控制方案制订，提供有效公共健康提议。
流感病毒实验室pcr检测技术
第18页
快诊应用价值
➢ 监测：为社会公众提供流感活动情况“早期预警”系 统。在一些国家快速检测已经被应用流感监测形成制 度，被用于病毒分离前标本筛选。不过WHO要求对 流感进行抗原分析，不推荐把快速检测作为监测单一 伎俩。
▪ TaqMan荧光探针工作原理:PCR扩增时,在加入一 对引物同时加入一个特异性荧光探针,探针两端分 别标识一个汇报荧光基团和淬灭荧光基团.探针完 整时,汇报基团发射荧光信号被淬灭基团吸 收;PCR扩增时 ,探针被酶切降解,汇报基团和淬灭 基团分离,从而荧光监测系统接到荧光信号,每扩 增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧 光信号累积与PCR产物形成完全同时
流感诊断的金标准
流感诊断的金标准
流感即流行性感冒，诊断的金标准通常被认为是病毒分离培养。
这种方法可以直接从患者体内分离出流感病毒，是确诊流感的最可靠方法。
然而，由于病毒分离培养需要一定的时间和实验条件，因此在实际操作中，医生通常会结合患者的流行病学史、临床症状以及其他实验室检查结果进行综合判断。
流感诊断的金标准是通过实验室检测直接从患者体内分离并鉴定出流感病毒。
具体来说，包括以下几个步骤：
1. 病毒核酸检测：实时荧光定量PCR（RT-PCR）是目前临床最常用的流感病毒检测方法，它能直接检测到患者呼吸道分泌物（如鼻咽拭子、喉咙拭子或痰液样本）中流感病毒的核酸（RNA），从而确定是否感染了流感病毒。
2. 病毒分离培养：在特殊细胞上培养患者的呼吸道分泌物标本，并观察是否有病毒生长和特征性的细胞病变效应，然后进一步通过免疫学或分子生物学技术鉴定病毒种类。
3. 血清学检测：虽然不是即时诊断手段，但在疾病恢复期采集血清进行抗体检测，对比发病初期和恢复期双份血清中的抗流感病毒抗体滴度变化，若4倍以上升高则有助于回顾性诊断。
根据国家卫生健康委员会发布的流感诊断标准，结合病人的流行病学史（如近期接触史、疫区旅行史等）和临床表现（如突发高热、咳嗽、头痛、肌痛、乏力等症状），可以初步怀疑流感。
但最终确诊
通常依赖于上述实验室检查的结果。
特别是在流感流行季节或者发生流感样症状的群体中，实验室检测是必不可少的确诊环节。
总之，流感诊断的金标准是病毒分离培养，但在实际操作中，医生需要综合考虑患者的流行病学史、临床症状以及实验室检查结果进行综合判断。
流感病毒及实验室检测
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目录
• 流感病毒概述 • 流感病毒的实验室检测方法 • 实验室检测流程与规范 • 流感病毒的变异与进化 • 流感病毒的防治与未来展望 • 相关案例分析
01
流感病毒概述
Chapter
病毒类型与特点
流感病毒属于正粘病毒科，具有包膜、分节段和基因组 等特点。
根据病毒核蛋白和基质蛋白的不同，流感病毒可分为甲 、乙、丙三型，每型又根据病毒的抗原性不同分为若干 亚型。 流感病毒的遗传物质为RNA，具有高变异性，易引起病 毒株的变异和流行。
03
对于流感患者，应 及时隔离和治疗， 以减少病毒的传播 。
04
针对易感人群和高 危人群，可采取抗 病毒药物预防和治 疗。
02
流感病毒的实验室检测方法
Chapter
抗原检测
01
02
03
直接免疫荧光法
利用特异性抗体标记荧光 素，直接检测样本中的流 感病毒抗原。
间接免疫荧光法
将样本与特异性抗体结合 ，再与荧光素标记的抗抗 体结合，检测流感病毒抗 原。
规范操作
实验操作应严格按照实验室规范进行 ，防止因操作不当导致的病毒感染或 实验室事故。
04
流感病毒的变异与进化
Chapter
病毒变异类型与特点
抗原性变异
导致病毒的表面抗原结构发生变 化，从而产生新的病毒株。这种 变异是随机的、不定向的，并可 能导致病毒逃逸免疫系统的识别
和攻击。
宿主适应性变异
使病毒能够在不同的宿主环境中 生存和传播。这种变异通常涉及 到病毒的基因组中的多个位点， 并可能导致病毒对特定宿主产生
更强的致病性。
耐药性变异
使病毒对特定的抗病毒药物产生 抵抗力。这种变异通常是由于病 毒基因组中的突变积累所致，并 可能导致病毒对多种药物产生耐
常用流感病毒实验室检测方法的比较
常用流感病毒实验室检测方法的比较摘要目的通过对四种常用流感病毒检测方法的比较，确定适用于常规监测及疫情暴发时的检测方法。
方法用四种方法对随机抽取的50份样品进行检测，对结果进行对比分析。
结果胶体金法虽简单快速，但漏检率较高（20.00%）；RT-PCR法灵敏快捷，准确度高（34.00%）；细胞培养法费用适中，检出率较高（14.00%）；鸡胚培养法检出率最低（2.00%）。
结论胶体金法适合疫情现场检测，RT-PCR法适合实验室内快速检测，组织培养法适合常规监测，鸡胚培养法适合流感疫苗生产。
关键词组织培养；鸡胚培养；病毒分离；RT-PCR；流感病毒现在实验室对流感病毒的检测手段有很多种，在本科室常用的方法有胶体金法、细胞培养法、鸡胚培养法、RT-PCR法四种。
为实际工作中找到最适合的检测方法，更及时准确的提供检测结果，对实验室常用的四种流感病毒检测方法进行比较。
现报告如下。
1 资料与方法1. 1 检测样品2014年1～4月份本院对就诊的流感样病例（发热，体温≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一者，未服用过抗病毒药物[1]）采集的鼻咽拭子，随机抽取50份。
流感病毒采样管由北京友康恒业科技有限公司购买。
1. 2 实验方法1. 2. 1 胶体金法美国QUIDEL公司，QuickVue Influenza A+B Test，按照试剂盒说明书操作。
1. 2. 2 细胞培养法MDCK细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。
样品前处理：将采样管漩涡震荡10 s，反复挤压拭子头后弃去拭子，加入青霉素、链霉素、制霉菌素，4℃静置2 h。
细胞传代及病毒接种按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其实验技术》操作[2]。
样品接种MDCK细胞培养出的第一代病毒培养液用1%豚鼠血红血球进行微量血凝实验（haemagglutination assay，HA），HA≥1：8的第一代病毒培养液用血凝抑制法（hemagglutination inhibition，HI）进行流感病毒分型鉴定（鉴定试剂盒由国家流感中心提供）。
流感病毒的实验室检测方法及进展探究
（下转第138页）
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孕 妇 增 加到 一步 法的 2 倍以上；妊 娠 期 糖尿 病 检出率大幅 度 上 升由 11.13%上 升 达 30.71%。通 过 正 确的健 康 教育和 饮食 调整，二 周后监 测空腹、餐后1 h及餐后2 h指端血糖，331例中287例血糖达到控制要 求，2 6 例 控制不 满 意，经 过 进 一步 调 整 饮食 结 构，加强孕 期运 动后 基 本达 标，另外18例 转入内分泌 科 胰岛素 治 疗 有 效。孕 期大 多 数孕 妇血糖得以良好的控制，顺利度过妊娠中晚期，孕妇发生妊娠期高 血 压 疾 病，羊水 过 多，胎膜 早 破，巨大 儿，产后出血，新生 儿 窒 息，新 生儿低血糖等的风险以及剖宫产率均有下降，对改善妊娠结局有较 明显改善。 3 讨论与分析
流感病毒又称为：流行性感冒病毒，具 有超强的传染性、散 播 性，是一种R NA病毒，归属于正黏液病毒科。一般通过呼吸道感染 以及 人 类 或动物的呼吸、讲 话 等 途 径 进 行 传 播。传 播的效 果 极快， 短时间内就可造成大面积的患有流行性感冒病毒的病例产生。流感 病 毒主 要 分为三个 等 级，即甲型、乙型、丙 型。其中甲型流 感 病 毒是 一种急性的 流 感 病 毒，经 过 变 异发 展 后对人 类自身的伤 害巨大，死 亡率 较 高。流 感 病 毒 实验 室的建 立在于研 究流 感 病 毒，分析 和总 结 出流感病毒的分布范围以及发展趋势，对我国预防和治疗流感性病 毒 具 有至关 重 要的作用。
流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程1. 引言流感病毒核酸检测是一种常用的检测方法，可以用于流感的早期诊断和监测。
本文档旨在提供流感病毒核酸检测标本采集、送检和处理的详细流程，以确保准确、及时和安全的检测结果。
2. 标本采集标本采集是流感病毒核酸检测的第一步，正确的采集方法对于后续检测结果至关重要。
以下是标本采集的步骤：1. 选择合适的采集时间：流感病毒在病程初期时最容易检测到，因此最好在症状开始后的48小时内采集标本。
2. 选择合适的采集方法：常见的标本采集方法包括咽拭子采集、鼻拭子采集和咳痰样本采集。
根据临床需要和采集者的经验选择合适的采集方法。
3. 采集过程：采集者应使用无菌手套，并根据操作要求进行准确的采集。
在采集过程中，要避免其他污染源的接触，确保标本的纯净度。
4. 标本保存和运输：采集后，标本应立即储存于适当的中，并在规定的时间内送往实验室进行处理。
3. 送检送检是将采集的标本送往实验室进行核酸检测的步骤。
以下是送检的流程：1. 填写申请单：在送检前，检测人员应填写标本的相关信息，如姓名、性别、年龄等，并注明流感病毒核酸检测的要求。
2. 标本包装：将已采集的标本放入密封袋中，确保袋子密封良好，避免标本在运输过程中的泄漏。
3. 运输方式：根据实验室的要求，选择适当的运输方式。
一般情况下，标本应使用专用的运送盒，采取冷链运输以确保标本的质量。
4. 相关文件：将申请单和相关的送检文件一同放入密封袋中，以便实验室对标本的追踪和管理。
4. 处理流程实验室收到标本后，需要进行一系列处理步骤以获得准确的核酸检测结果。
以下是处理流程的主要步骤：1. 样本接收：实验室收到标本后，应及时确认标本的完整性和相关信息的准确性，并记录相关数据。
2. 样本处理：对标本进行必要的预处理，如离心、去除细胞和红细胞沉淀等，以提取标本中的核酸。
3. 核酸提取：使用合适的提取试剂和方法，从标本中提取核酸。
在提取过程中，应采取相关措施以防止实验室内的交叉污染。
流行性感冒时应做哪些实验室检查
流行性感冒时应做哪些实验室检查感冒是我们日常生活中是很常见的，流感是流行性感冒的简称，是流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病。
流感病毒传染性强，容易发生变异，一般人都易感，传染所致的发病率很高。
全世界已经出现屡次爆发性流感，据我们熟知，04年的非典，时常发生的禽流感，甲型H1N1流感，H7N9型禽流感，2022年初的新型冠状病毒，时至今日，我们日常出行还带着口罩，国外的病毒也还在持续蔓延，还未找到正在解决的有效方法。
而每一次的流感爆发也会引起全球人民关注公共卫生问题。
在我国，流感大多发生在冬季，春季也属于高发季节，会出现季节性流感。
流感的传播速度尤为惊人，人多的地方传播的速度更为吓人。
学校、托幼机构和养老院，车站，大型购物商场等人群聚集的场所，一旦有流感病毒，随即会发生爆发性流感疫情。
据世界卫生组织〔WHO〕估计，每年季节性流感在全球可导致300万～500万重症病例，29万～65万死亡。
所有5岁以下的儿童都被认为是重症流感的高危人群，但2岁以下儿童的风险最高，6个月以下的婴儿住院率和死亡率最高。
孕妇、婴幼儿、老年人和慢性根底疾病患者等高危人群，患流感后出现严重疾病和死亡的风险较高。
目前来说，接种流感疫苗是预防流感病毒感染及其严重并发症的最有效手段。
流感是一种具有很高发病率的疾病，在流感流行的季节，很多朋友都容易患上流感。
如果疑心得了流感，出现发烧或体温低，伴随咳嗽，喉咙痛，或者喘不过气来，就需要及时去医院，一定得去医院让医生来治疗，不能耽误病情。
医生通常因为流感入院，医生会根据多年的临床经验来判断，通过患者的个人表现来判断大致的病情情况，并开出一些检查单，让你去做哪些实验室检查，根据实验室的检查单来判定是否是流感，目前实验室检测室判定流感疾病的最关键方法。
一、鼻咽试子检测。
鼻咽试子检测是一种医学检测方法，是用医用的棉签，从人体的鼻咽部粘取少量分泌物，接种于特质培养皿中，放置在一个可以控制温度的设备内进行培养的过程。
人禽流感病毒及实验室检验技术相关试题及答案
人禽流感病毒及实验室检验技术相关试题及答案血抑（HI）试验结果判读时，应在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，将反应板作（）倾斜，从反应板背侧观察A、30°B、45°C、60°D、90°中国流感/人禽流感监测信息系统至少有（）个国家级网络实验室A、60B、120C、190D、340微量血抑（HI）试验应制备相应亚型的（）个血凝单位的抗原A、4B、8C、12D、6一般来讲，（）亚型病毒同普通流感所致临床表现类似A、H10B、H5C、H9D、H6人禽流感病毒在感染细胞内的复制过程，不包括以下哪项（）A、包装与释放B、转录与复制C、收缩与舒张D、吸附与侵入血凝（HA）试验原理是HA能与人或其它动物多种红细胞表面（）受体结合引起红细胞凝集A、N-乙酰胆碱B、N－乙酰神经氨酸酶C、M-甲基多氨D、F-乙酰酯酶人禽流感病毒核酸检测，分子信标法的缺点是（）A、无模板特异性B、成本高C、不能做多重检测D、稳定性差，探针合成时标记较复杂人禽流感病毒检测接种鸡胚，样本需要在温度33-35℃、湿度40-60%条件下孵育（）A、2-3天B、5-7天C、2-3小时D、5-7小时人禽流感病毒核酸检测，罗氏454/GS FLX测序仪的整个实验步骤不包括以下哪项（）A、样品处理B、PacBioC、反应板准备D、文库制备人禽流感病毒核酸检测，以下哪项不属于SYBR GreenⅠ法的缺点（）A、不能做多重检测B、灵敏度低C、无模板特异性D、稳定性差病毒分离培养法中，MDCK细胞对（）相毒株比较敏感A、0B、VC、BD、F以下哪项不属于人禽流感病毒核酸检测方法（）A、PCRB、Real-time PCRC、基因芯片D、鸡胚接种人禽流感病毒基因组为（）个分节段单股负链RNAA、6B、7C、8D、9答案：BABCCBDABDADC。
甲流检测步骤
甲流检测步骤
甲流是由甲型流感病毒引起的呼吸道传染病，其检测步骤主要包括以下几个方面：
1.病史询问和体格检查：医生会询问患者是否有流感症状，如
发热、咳嗽、喉咙痛等，并检查患者的体温、呼吸、心跳等表现。
2.实验室检测：医生可能会进行实验室检测以确认是否感染了
甲型流感病毒。
常用的检测方法包括：
- 咽拭子样本：医生用棉签或专用拭子在咽喉部取样，将样本
送到实验室进行病毒核酸检测，来确定是否存在甲型流感病毒。
- 血液检测：医生可能会抽取患者的血液样本，通过血液检测
寻找甲型流感病毒的抗体或病毒核酸。
3.其他辅助检查：医生可能会要求进行其他辅助检查，如X光检查或者胸部CT扫描，以了解病毒是否引起了其他并发症，
如肺炎。
值得注意的是，专业的医生和医疗机构会有相应的流感检测指南，并根据具体情况进行相应的检测。
因此，如果出现流感症状或怀疑感染甲型流感，最好及时就医并遵循医生的建议进行检测。
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Hank’s液清洗细胞
加入病毒生长液，33－35度培养箱培养
MDCK细胞病毒分离
CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性 有关 每日观察细胞病变(CPE) 标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA 试验阴性者，继续盲传1～2代后，HA试验 仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴 性，标本可弃去
50ul
50ul
A B C
D
E
F
G H
稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液
病 毒 原 液
1：2
1：128
HA：
32
HA＞128 HA： 4
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。 • 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于 MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接 种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测
程序实时调整）
实验室检测
◆核酸检测
◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养
◆胶体金快速检测
荧光PCR结果－阳性样品
荧光PCR结果－阴性样品
荧光PCR结果－可疑样品
病毒分离-MDCK细胞
标本接种MDCK细胞 33－35℃培养 每日观察细胞病变(CPE)
MDCK细胞收获
接种流程
清洗MDCK 细胞 Hank’s液清洗细胞，一般清洗2遍 临床采样标本接种细胞
流 程 图
根据使用的细胞瓶的大小，决定接种 量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临 床标本
暴发疫情标本采集
• （1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例； • （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。
• 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。
33－35度吸附1－2小时 24小时后，观察细胞病变。当细 胞病变为3+或4+时，即75～100% 细胞出现病变时进行收获，收获 之前将细胞冻融1～2次，以提高 收获标本的病毒滴度。即使无细 胞病变也应该于第7天收获 （细胞 病变情况：细胞病变的特征是细 胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细 胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落 ）
鸡胚分离方法-标记鸡胚
检视标记鸡胚 ◆ 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 ◆ 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部 的位臵 ◆ 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育 不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
荧光定量PCR
• 引物和探针
– 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避 光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）； – 涡旋振荡引物和探针； – 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
• real-time RT-PCR的试剂
– QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443
荧光定量PCR
• 第一次使用前引物稀释
• 1．引物工作浓度（40μM） • 配制方法：
– （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引 物浓度为100μM，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的 量为9.1 nmol ，加水量为10×9.1＝91μl） – （3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。
流感病毒实验室检测技术 及盲样考核结果分析
湖南省疾病预防控制中心
微生物检验科 黄一伟 2013-12-27
流感监测目的
• （一）监测流感活动水平和流行动态；
• （二）及时发现流感病毒变异并作出预警； • （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。
流感监测内容
• （一）流感样病例监测
• （二）流感样病例暴发疫情监测
细胞病变图
鸡胚病毒分离
标本准备 检卵 标本接种于9日龄鸡胚 33℃～35℃培养72小时
鸡胚分离方法-试剂准备
1) 9～11日龄鸡胚 2) 照蛋灯 3) 70%～75％酒精 4) 1ml 一次性注射器 5) 鸡蛋开孔器 6) 无菌胶布或蜡 7) 10ml 试管和试管架 8) 10ml 移液管或1ml移液器及无菌吸尖 9) 无菌镊子 10) 无菌眼科剪
– 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶) – 正反向引物 (40μM) – 双重标记探针(10μM)
• 反应条件：逆转录50℃ 30min→95 ℃ 2min → （95 ℃ 15s → 55 ℃ 30s*）×45 • 反应体系为25ul • 注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号 （FAM）
• 2．探针工作浓度（10/20μM/） • 配制方法：
– （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物 浓度为100μM，可作为储存液。 – （3）将100μM的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20μM，可作为工作浓度。
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鸡胚分离方法
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接种病毒方法 单腔接种
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盲种
◆双腔接种
灯下接种 开窗接种
鸡胚分离流程（1）
◆将标记好的鸡胚的气室朝上放臵在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚 ◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm 窗口 ◆用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位臵。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100µl标本。将针头退出至 ½ 寸，将另外100 µl标本 注入鸡胚尿囊腔
鸡胚分离流程（2）
◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种
另外的两枚鸡胚 ◆将针头弃于合适的生物安全装臵中 ◆用消毒过的医用胶布封口 ◆ 33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样 标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚 生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非 特异死亡应弃去
实验室生物安全要求
季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级 实验室进行。
流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。 用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全Ⅰ级实验室进行
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本 后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
红细胞 适用范围 终 浓 度 （％） 孔底部形 状 孵育时间 细胞对照
鸡 流感和禽流 感病毒 0.5（1%）
火鸡 流感和禽 流感病毒 0.5（1%）
豚鼠 流感病毒
人O型血红 细胞 流感病毒
马 禽流感病毒
U或V型
30min 细胞沉积成 圆点状，倾 斜时细胞向 下流成泪滴 状
U或V型
0.75 （ 1.5% ） 0.75 （ 1.5% ） 0.5（1%） /0.5（1%） /0.5（1%） U型 U型 U型 45min 细胞沉积成 环状 60min 细胞沉积成 环状
30min 45min 细胞沉积 细胞沉积成 成 圆 点 状 ， 环状 倾斜时细 胞向下流 成泪滴状
50ulPBS
100ul病毒液
稀释病毒 加入配制好 的红细胞悬 液 充分混匀， 置室温孵育 30-60分钟 观察记录结 果
50ul
50ul 50ul
50ul 50ul
50ul
50ul
50ul 50ul 50ul
采集标本类型
常规
咽拭子 鼻拭子 痰液
特殊
鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本
采样液
• 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液或 MEM； • 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250μg/mL ）
鸡胚病毒鉴定
鸡胚收获 HA试验
经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继 续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚 病毒分离为阴性，标本可弃去
病毒鉴定
• 红细胞凝集 • 红细胞凝集抑制试验
病毒鉴定流程
红细胞凝集试验
4个凝集单位配制“回滴”
红细胞凝集抑制试验
测流程
临床标本采集 流感病毒核酸检测阳性 接种MDCK细胞 接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
核酸检测
• 核酸提取- QIAamp® Viral RNA Mini Kit • 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 • 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 ％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 • 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 • 4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 • 5）重复步骤4。 • 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 • 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 • 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。