9.流感病毒的快速检测方法

流感病毒的快速检测方法

一、RT-PCR快速诊断方法

（一）生物安全要求

（二）病毒核酸提取

（三）RT-PCR

（四）PCR 产物纯化

（五）流感病毒RT-PCR检测引物

二、免疫荧光方法检测流感病毒

（一）原理

（二）标本处理

（三）间接免疫荧光法

（四）结果判断

三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测

（一）基本原理

（二）实验试剂

（三）实验步骤

四、快速诊断试剂盒

流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。

一、RT-PCR快速诊断方法

核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。

流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。

RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。

（一）生物安全要求

生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。

（二）病毒核酸提取

1. 实验材料及仪器

(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104）

(2) β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）

(3) 70% 乙醇

(4) 无菌1.5ml 离心管

(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头

(6) 可调14K微型离心机

(7) 旋转混合器

2. 操作步骤

(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管，加入500μl RLT。

(2) 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或

细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。

(3) 加5μl β-巯基乙醇，充分混匀。

(4) 加600μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。

(5) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。

(6) 将第4步的混合液体分两次（每次600μl）吸入于滤柱中，12000rpm

离心15秒，弃收集管中的离心液。

(7) 滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm

离心15秒，弃收集管中液体。

(8) 于滤柱中加入700μl RW1，12000rpm 离心15秒。

(9) 从试剂盒中取出一支新的2ml收集管，将离心后的滤柱转到新的收集

管上，于柱子中加入500μl RPE，12000rpm 离心15秒弃收集管中液

体。

(10) 滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500μl RPE，13000～14000rpm 离

心2分钟。

(11) 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，将滤柱转到新的1.5ml管上，

于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶的水，室温静置1～3分钟。

(12) 12000rpm 离心1分钟，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，

可以直接用于逆转录实验，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4个

月。

3. 注意事项

(1) 试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。

(2) 所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。

（三）R T-PCR

1. 一步法RT-PCR

(1) 实验材料

1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 210212

2) RNase inhibitor 40u/μl（Promega）

3) 上游引物200ng/μl

4) 下游引物200ng/μl

5) 模板RNA（Templet RNA）

(2) 实验步骤

1) PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室）

无RNA酶水（Rnase Free Water）28.75μl

5×Buffer 10μl

10mM dNTP 2μl

Enzyme Mix 2μl

Rnase inhi bitor 0.25μl

上游引物1μl

下游引物1μl

RNA 模板5μl

总量：50μl

2) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪

3) RT-PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，

相应的反应条件需要做适当调整。

→60℃ 1 min

→42℃10 min

→50℃30 min

→95℃15 min

→94℃30 sec

→52℃30 sec

→72℃ 1 min

→返回第5部，循环34次

→72℃10 min

→4℃保存

4) PCR产物检测

琼脂糖凝胶配置：用1×TBE 将琼脂糖配成1.2%～1.5%溶液，加热使之完全溶解。冷却到50～60℃时加入溴化乙锭（Ethidium Bromide EB，10ug/μl），终浓度为0.5μg/ml。

PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer ，使它淹没过胶面。每份标本取4μl PCR产物，与1μl 5×Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶的第一孔加入5μl分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v，电泳时间约30～40min。

结果分析：用UV～254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm 下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。

5) 注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋统一处理。

含有EB的凝胶处理方法：

→加1倍体积的0.5mol/L KMnO4,小心混匀。

→加入1倍体积的2.5 mol/L HCl,小心混匀。于室温放置数小时。

→加入1倍体积的2.5 mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。