浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析

浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析施思;彭智辅;乔宗伟;刘多涛;罗青春;涂福明【摘要】为了探究大曲贮藏过程中微生物群落结构变化,采用高通量测序技术分析了真菌18S rDNA V4区,聚类分析共产生3 747个OTU分类.结果表明,在贮藏过程中大曲真菌群落结构不断调整,毕赤酵母属、根霉菌属及横梗霉属成为最终的优势菌群.随着时间的推移,大曲发酵力逐渐升高,而糖化力则经历了由高变低再升高的过程.数据结果与大曲质量要求相符,能为后续酿造提供足够动力.%To explore the change of microorganisms communities of Daqu in the storage process,the V4 regions of fungal 18S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing,3747 OTUs were obtained in clustering analysis.The results showed that fungal community structure was constantly adjusted,Pichia,Rhizopus,Lichtheinia became the dominant genera at the end of storage.The fermenting power of Daqu gradually increased as time going on,while saccharifying power gradually decreased and then increased again.The data meet the requirements for quality of Daqu,which can provide enough power for the subsequent brewing.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)005【总页数】4页(P76-79)【关键词】大曲;储藏;真菌多样性;理化指标【作者】施思;彭智辅;乔宗伟;刘多涛;罗青春;涂福明【作者单位】五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007【正文语种】中文在我国传统酿酒行业一直流传着“曲乃酒之骨”的说法，曲药既是酿酒的糖化发酵剂，又是酿酒的重要原料，同时为酿酒提供部分风味物质或风味前体物质，对白酒的香型风格有着举足轻重的作用。

五粮液作为中国浓香型白酒的典型代表，采用了独特的“包包曲”制曲工艺，以小麦为原料，经粉碎、加水拌合压制而成，天然接种，多微共酵。

作为中国传统酿造的浓香型白酒大曲，其微生物菌群的丰富度不言而喻，微生物的生长代谢也决定着大曲品质的优良。

近年来，随着测序技术的迅猛发展，广大科研工作者为了更加全面的认识曲药微生物，采用免培养技术做了大量研究。

梁晨等人采用Mi Seq测序方法研究了大曲贮存过程中原核微生物群落结构演替规律，共得到3 710个OTUs，指出乳杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、高温放线菌属、乳球菌属等是大曲中的优势菌群[1]；高亦豹等人利用PCR-DGGE技术对江苏北部某酒厂高温和中温大曲细菌菌群结构进行了分析，检测到了传统方法未能分离鉴定的Staphylococcus xylosus、Klebsiella oxytoca[2]。

另外，孟镇等人运用DGGE 技术及条带测序解析了山东某酒厂浓香型白酒大曲的细菌菌群，其结果显示了该酒厂大曲中细菌主要属于厚壁菌门[3]；罗惠波等人利用PCR-SSCP技术对泸州老窖大曲发酵过程中原核微生物菌群结构进行了研究，结果发现大曲发酵温度的变化对原核微生物多样性影响较小，而发酵后期的湿度、水分可能是造成原核微生物多样性改变的重要原因[4]。

大量研究结果表明，免培养方法检测大曲微生物组成更为直观、高效和全面。

综合浓香型大曲微生物研究现状和研究手段可知，利用高通量测序技术对真菌微生物的研究相对较少，而大曲作为糖化发酵剂，糖化力和发酵力是衡量大曲质量的重要指标，与之相关的微生物更是研究热点。

而大曲在投入生产前会经过长达数月的储存过程，期间发生多种生化反应，使得微生物区系结构、酶系结构、物系结构都会发生重大变化，是重要的后熟过程，对最终曲药质量产生重要影响，也很有必要对其进行深入研究。

因此本研究选取储藏期大曲样本进行针对18S rDNA V4区高通量测序，并跟踪检测其糖化力发酵力变化规律，一方面可以了解大曲微生物菌群的基本构成和丰度变化，弄清微生物多样性的构成差异与不同大曲质量的相关关系，另一方面，研究结果可以为更好地理解大曲贮藏的科学必要性提供一些参考数据及新的思路。

1.1 曲样选取五粮液制曲车间某一陈化曲库，在其储存过程中进行定点跟踪取样，每月1次，共计5个样品。

样品破碎成粉后用无菌袋密封，按取样时间依次标记为1、2、3、4、5。

1.2 主要试剂与仪器1.2.1 试剂真菌宏基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)；Q10212 Qubit2.0 DNA检测试剂盒(life)；V43NDF引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGA￣T￣C￣T￣N￣G￣G￣C￣A￣A￣G￣T￣C￣T￣G￣G￣TGCCAG；EukV4R引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACC￣C￣G￣A￣G￣A￣A￣TTCCAACGGTATCTRATCRTCTTCG。

(上海生工)；理化检测试剂均为国产分析纯。

1.2.2 仪器UNIVERSAL 320R冷冻离心机；HWS26型电热恒温数字水浴锅；T100TM Thermal Cyeler PCR仪；DYCZ-21电泳槽；美国UVP凝胶成像系统等。

1.3 实验方法1.3.1 宏基因组提取采用差速离心法收集微生物细胞沉淀[1]，采取反复冻融与试剂盒相结合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。

按照产品说明书进行操作。

1.3.2 PCR扩增利用引物V43NDF和EukV4R对大曲真菌基因组18S rDNA V4进行扩增。

扩增体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L each) 0.5μL，DNA10 ng，引物F(50 μmol/L)0.5 μL，引物R (50 μmol/L)0.5 μL，Plantium Taq(5U/μL)0.5 μL。

扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共20个循环；72 ℃ 5 min。

1.3.3 DNA纯化及高通量测序DNA纯化及高通量测序由上海生工有限公司完成。

利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1∶1的等量混合后测序。

等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。

高通量测序数据主要采用Mothur和Excel软件进行统计和分析，将相关序列提交NCBI数据库进行BLAST同源性比较。

按照0.03的离散度聚类生成OTU，与RDP数据库比对得到物种分类信息，并计算每个样品的Chao1值，Shannon指数等。

1.3.4 糖化力及发酵力测定按照五粮液企业技术标准执行(2005年颁布)。

糖化力：1 g绝干曲，在30 ℃、pH4.6、60 min分解可溶性淀粉为葡萄糖的质量(mg)，即mg/(g·h)，底物为2.0%的可溶性淀粉溶液；发酵力：1 g绝干曲在30 ℃发酵72 h利用蔗糖产生CO2的体积(mL)，即mL/(g·72 h)，底物为8%的蔗糖溶液。

2.1 真菌多样性分析2.1.1 测序序列数目和多样性指数分析由图1及表1的Coverage指数可知，取样覆盖率均超过97%以上，样品随着测序序列数的增加，多样性指数曲线趋于平坦，说明本次试验取样合理，结果能代表样本的真实情况，更多的取样仅会产生少量的OTU。

对各样本测序序列进行质控过滤后，大曲储藏过程中的5个样本测序共获得116 122条序列，聚类分析共产生3 747个OTU分类。

Shannon 指数、Chao1指数是常用的描述群落物种多样性的指数，其中，Shannon值越大，说明群落多样性越高；Chao1指数常用来估计物种总数，其值越高，物种丰富度越高[5]。

由表1可知，大曲真菌微生物多样性随着储存时间的推移，Shannon index有所上升，接下来则需弄清微生物组成具体发生了哪些变化。

2.1.2 OTU分布的Venn图Venn图可以用来统计样本中共有和独有的OTU的数目，直观地展现样品OTU数目组成的相似性及重叠情况。

如图2所示，样品1到5独有的OTU数目依次为654、667、737、680和590，均远远超过自身总OTU的半数以上；5个样品共有的OTU仅28个，其所代表的真菌物种长期存在于储藏期内。

通过Venn图可以看出，每个样品都具有极高的特异性，说明真菌结构随着时间的变迁发生了较大的改变。

接下来，我们将通过真菌多样性分析，弄清哪些物种的改变和数量的变化造成了这样的差异。

2.1.3 大曲贮藏过程中不同时期真菌多样性分析对样品中物种多样性进行分类分析，可以得到以下2个信息：(1)样品中含有何种微生物；(2)各微生物的相对丰度。

为了展示效果，一般只显示相对丰度前50的物种分类，剩余物种合并为other。

如图3所示，在属水平上大曲贮藏过程中真菌多样性有较为明显的差异。

大曲贮藏初始阶段，毕赤酵母属(Pichia)所占比例最高为42.27%，是样品1中第一大优势属，其次枝氯霉属(Ramichloridium)也是主要真菌类群，所占比例为26.09%。

复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、根霉菌属(Rhizopus)和横梗霉属(Lichtheinia)也被检测到，所占比例分别为6.03%、5.24%和3.34%。

此外，一类分类信息不明的真菌类群(unclassified)所占比例达到了12.4%。

随着时间的推移，Ramichloridium 不再是优势真菌，而Pichia比例也略有下降，在贮藏末期(样品5)中占比为28.11%，不过仍为相对数量最多的优势真菌；Rhizopus数量则稳步增加，最后比例达到了17.37%。