Promega--双萤光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因引言。
双荧光素酶报告基因是一种常用的生物标记物，用于研究基因表达和调控。
它具有高灵敏度、快速检测和定量分析等优点，因此在生物医学研究和药物开发领域得到了广泛应用。
本文将从双荧光素酶报告基因的原理、应用和未来发展等方面进行综述，以期为相关研究提供参考。
一、双荧光素酶报告基因的原理。
双荧光素酶报告基因是一种能够产生荧光信号的基因，它通常由双荧光素酶（Dual-Luciferase）和报告基因组成。
双荧光素酶包括火榴石荧光素酶（Renilla luciferase）和荧光素酶（Firefly luciferase），它们分别与不同的底物反应产生荧光信号。
报告基因则是研究对象的基因序列，它与双荧光素酶组成一个转录单元，用于研究基因表达水平和调控机制。
双荧光素酶报告基因的原理是利用荧光素酶和火榴石荧光素酶分别与其底物反应产生荧光信号，通过检测这两种荧光信号的强度来分析报告基因的表达水平。
这种双荧光素酶系统具有高灵敏度和宽线性范围，能够准确测定低至飞阿尔茨海默病荧光素酶单位的荧光信号。
二、双荧光素酶报告基因的应用。
1. 基因表达调控研究。
双荧光素酶报告基因广泛应用于基因表达调控研究中，可以通过构建报告基因的启动子激活元件来分析转录因子的结合位点和调控机制。
研究人员可以利用双荧光素酶报告基因系统来研究基因的转录调控网络，揭示基因表达的调控机制。
2. 药物筛选和毒性评价。
双荧光素酶报告基因系统在药物筛选和毒性评价方面也有广泛应用。
研究人员可以利用该系统来筛选具有调控作用的化合物，评估药物的毒性和副作用，为药物研发提供重要参考。
3. 细胞信号转导研究。
双荧光素酶报告基因系统还可以用于细胞信号转导研究，通过构建信号通路相关基因的报告基因来分析细胞信号传导的机制和调控网络，为疾病治疗和药物开发提供理论基础。
4. 生物传感器开发。
双荧光素酶报告基因系统还可以应用于生物传感器的开发，通过构建特定的报告基因来实现对特定生物分子的高灵敏度检测，为环境监测和生物医学诊断提供新的手段。
美谷分子酶标仪：如何用注射器卡盒在酶标仪上进行双荧光素酶报告基因实验(DLR)
美谷分子酶标仪：如何用注射器卡盒在酶标仪上进行双荧光素酶报告基因实验（DLR）简介报告基因实验一般用来研究真核生物的基因表达。
在双报告基因实验中，细胞都转染了两种质粒，一种含有的目的基因调控的启动子，另一种包含一个质控基因的组成型启动子。
将目的报告基因与质控报告基因共转染，最小程度减少实验误差。
生物发光报告系统广泛联合使用萤火虫和海肾荧光素酶，因为它们都很容易操作且极其灵敏。
Promega公司的双报告基因实验(DLR)系统允许使用者在一个微孔板孔中分别检测萤火虫和海肾荧光素酶活性，其中萤火虫作为实验报告，海肾作为质控基因。
Figure 1展示了两个酶促反应，按顺序发生在相同的实验孔中。
萤火虫荧光素酶催化的荧光素的氧化会伴随着光的释放。
反应需要ATP, Mg2+ 和O2。
海肾荧光素酶催化氧气依赖型腔肠动物荧光素，但是不需要ATP或Mg2+。
酶有着不同的底物要求，所以它们可以在一个反应体系中完成。
双报告基因实验需求两种不同的试剂含有不同的底物，每次都需要进行化学发光读数。
这种实验流程可以轻松在SpectraMax i3x多功能酶标仪的注射器卡盒上进行，这套体系已通过DLReady体系认证。
我们在这篇应用文章中向大家展示了重组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的6个数量级的线性范围检测，同时进行了每孔195到25000个被转染细胞的线性检测。
Figure 1. Reactions catalyzed by firefly and Renilla luciferases. Firefly and Renillaluciferasehave different substrate requirements.优势•6数量级线性范围的高灵敏度荧光素酶定量检测•利用SoftMax Pro软件自动分析和计算数据，实现报告基因规范化检测•智能加样技术优化试剂混匀结果材料双报告基因实验系统(Promega cat.#E1960)，包括：•荧光素酶检测试剂II•荧光素酶检测底物•Stop & Glo 缓冲液•Stop & Glo 底物•5X Passive 裂解缓冲液纯化重组荧光素酶:•萤火虫荧光素酶: QuantiLum® Recombinant Luciferase (Promega cat. #E1701)•海肾荧光素酶: Recombinant Renilla Luciferase (RayBiotech cat. # RB-15-0003P-10) CHO-K1 细胞(ATCC cat.#CCL-61)质控荧光素酶质粒:•pGL4.13[luc2/SV40] 萤火虫荧光素酶质粒(Promega cat. #E6681)•pGL4.74[hRluc/TK] 海肾萤火虫酶质粒(Promega cat. #E6921)Fugene高效转染试剂(Promega cat.#E2311)6孔组织培养板(Corning cat. #3516)96孔平底底透白色TC处理板(Corning cat. #3610)光学放大的封膜(Genesee cat.#12-639)白色96和384孔微孔板(Greiner cat.#655075 and #781075)SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机SpectraMax 注射器卡盒方法酶标准曲线制备萤火虫荧光素酶贮存液，用含有1mg/mL BSA的1X Passive 裂解缓冲液（PLB，一种双荧光素报告实验系统）将贮存液从12.4mg/ml稀释到1mg/ml。
双荧光素酶报告基因检测实验步骤
双荧光素酶报告基因检测实验步骤引言：双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。
本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。
一、材料准备1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。
2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。
3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。
4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。
5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。
二、细胞处理1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。
2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。
3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。
三、荧光素酶检测1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。
3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。
4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。
四、数据处理与分析1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。
2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。
3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。
4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。
五、注意事项1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。
双荧光素酶报告基因实验步骤
生物试剂双荧光素酶报告基因实验详解
如果要研究特定基因在体内的表达情况，常常采用转染法将双荧
光素酶报告基因植入目标细胞，在其表达后添加荧光素底物观察样品
中的荧光反应。
以下是使用该方法的实验步骤。
1. 构建双荧光素酶报告基因
首先需要构建双荧光素酶报告基因质粒，一般包括荧光素酶基因
和双荧光素酶基因，常用的是pGL3系列荧光素酶报告质粒和pRL-TK
双荧光素酶报告质粒，它们均是双质粒，具有耐药性和多克隆位点。
为了使荧光素底物反应在细胞中时产生荧光信号较强，需要在LUC和RLUC序列之前插入适当的顺式依赖启动子和增强子。
2. 细胞系的选择及转染
可以根据实验需要选择最适合的细胞系，例如HEK293、HeLa等。
将转染载体和搭配的化学试剂（如Lipofectamine 2000）按照实验方
案设定的比例混合，加入到无血清培养基中和细胞悬液混合，然后在
适当的时间内（如26-30小时）取样观察表达情况和筛选。
3. 荧光素底物检测
荧光素底物可以通过公司购买，也可以自制。
将荧光素底物溶解
在试剂液中，加入细胞中，等待几分钟可以看到发出荧光的细胞。
注意：在观察荧光之前，需在处理样品之前过滤荧光素底物以去除杂质。
另外，使用荧光计或流式细胞检测仪记录荧光信号，荧光信号强度与细胞内琥珀酸盐浓度成比例，可用于定量分析。
总之，双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学技术，可以用于基因表达、基因调节和蛋白质交互作用研究等方面，具有广泛的应用前景。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因及其应用双荧光素酶报告基因是一种经常用于生物学研究中的功能基因，它在研究细胞内转录调控、蛋白质相互作用、酶活性等方面具有广泛的应用。
本文将介绍双荧光素酶报告基因的特点、原理以及其在生物学研究中的应用。
首先，我们来了解一下双荧光素酶报告基因的特点。
双荧光素酶报告基因是通过核酸序列工程手段将双荧光素酶基因（Luciferase）与报告基因的表达序列融合而成。
这种融合基因可以在转染至细胞后，通过测定荧光素酶的活性来间接反映报告基因的表达水平。
双荧光素酶报告基因具有高灵敏度、高稳定性和广泛的线性范围等特点，使其成为现代生物学研究中非常重要的工具。
其次，我们来介绍一下双荧光素酶报告基因的原理。
双荧光素酶报告基因的原理基于荧光素酶的催化反应。
荧光素酶是一类酶，它在存在特定底物（如荧光素）和辅因子（如ATP和Mg2+）的情况下，可以催化荧光素氧化产生光。
荧光素酶报告基因利用这种酶催化反应的特性，将荧光素酶与报告基因融合，使得报告基因的表达水平可以通过测定荧光素酶的活性来间接确定。
双荧光素酶报告基因在生物学研究中有许多应用。
首先，它常被用于研究基因的转录调控。
研究人员可以将感兴趣的启动子区域与双荧光素酶报告基因融合，通过测定荧光素酶的活性来评估该启动子区域的转录活性。
这种方法可以帮助我们了解基因的调控机制以及某些转录因子的作用。
其次，双荧光素酶报告基因也可以用于研究蛋白质的相互作用。
研究人员可以将目标蛋白与双荧光素酶报告基因的不同片段融合，通过测定荧光素酶的活性来评估蛋白质相互作用的强度和稳定性。
这种方法可以帮助我们了解蛋白质的功能以及蛋白质网络的调控机制。
另外，双荧光素酶报告基因还可以被用于研究酶活性和信号传导通路。
比如，在药物筛选中，可以将双荧光素酶报告基因与药物靶点融合，通过测定荧光素酶的活性来评估药物对靶点的抑制效果。
这种方法可以帮助我们筛选出有效的药物并研究其作用机制。
双荧光素酶报告基因检测
双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它利用双荧光素酶作为报告基因，通过检测其表达水平来研究目标基因的调控机制、信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
本文将介绍双荧光素酶报告基因检测的原理、应用及其在科研和临床中的意义。
双荧光素酶报告基因检测的原理是利用双荧光素酶基因（Luciferase）和绿色荧光蛋白基因（GFP）等作为报告基因，将其与目标基因的启动子或调控元件相连，构建成表达载体，转染到细胞中。
当目标基因的启动子或调控元件被激活时，报告基因也会被激活，从而产生荧光素酶或绿色荧光蛋白，可以通过荧光素酶活性检测或荧光显微镜观察来检测目标基因的表达水平和细胞定位。
双荧光素酶报告基因检测在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的调控机制。
通过构建不同长度或突变的启动子或调控元件，可以研究基因的启动子活性、转录因子结合位点以及信号通路的调控机制。
其次，它可以用于筛选药物或研究药物的作用机制。
通过将报告基因与目标基因共转染到细胞中，可以研究药物对目标基因表达的影响，从而筛选出具有特定生物学活性的化合物。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于研究基因的表达模式、细胞信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
在临床诊断中，双荧光素酶报告基因检测也有着重要的意义。
例如，在肿瘤诊断中，可以利用双荧光素酶报告基因检测来研究肿瘤相关基因的表达水平，从而为肿瘤的分子诊断和靶向治疗提供依据。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于检测病毒感染、细胞凋亡、细胞增殖等生物学过程，为临床诊断和治疗提供重要参考。
总之，双荧光素酶报告基因检测作为一种重要的生物学检测技术，在科研和临床中有着广泛的应用前景。
它不仅可以帮助科研人员深入研究基因调控机制和疾病发生发展的相关机制，还可以为临床诊断和治疗提供重要的实验依据。
相信随着技术的不断进步和完善，双荧光素酶报告基因检测将在生物学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因表达、蛋白质相互作用等生物学过程。
下面将介绍双荧光素酶报告基因实验的详细步骤，希望能对您的实验工作有所帮助。
1. 质粒构建。
首先，需要将双荧光素酶报告基因构建到适当的表达载体中。
一般来说，可以选择pGL3基因表达载体，将双荧光素酶报告基因插入到该载体的多克隆位点中。
构建好的质粒可以用于转染细胞进行后续的实验操作。
2. 细胞培养。
接下来，需要选择适当的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa等。
将选定的细胞系进行培养，直至细胞密度达到要求，可以进行后续的转染实验。
3. DNA转染。
将构建好的双荧光素酶报告基因质粒转染至培养好的细胞中。
可以选择合适的转染试剂，按照试剂说明书的操作步骤进行转染。
转染后，将细胞培养在含有适当抗性筛选剂的培养基中，以筛选转染成功的细胞。
4. 荧光素酶活性检测。
转染后的细胞需要进行荧光素酶活性检测。
首先将培养基抽取，然后加入荧光素底物，测定细胞中荧光素酶的活性。
可以使用荧光素酶检测试剂盒进行操作，按照说明书进行操作。
5. 双荧光素酶报告基因实验结果分析。
最后，根据实验结果进行数据分析。
可以通过比较不同组的荧光素酶活性来研究基因的表达水平，或者研究蛋白质的相互作用等生物学过程。
通过实验结果，可以得出相应的结论并进行讨论。
以上就是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤。
希望对进行该实验的科研工作者有所帮助，也希望大家能够在实验中取得理想的结果。
祝实验顺利！。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因双荧光素酶（dual-luciferase）报告基因是一种常用的生物学工具，广泛应用于生物荧光信号的定量检测。
它可以帮助科研人员更准确地研究细胞的生物过程，如基因表达调控、蛋白质相互作用等。
本文将介绍双荧光素酶报告基因的原理、应用以及未来的发展方向。
双荧光素酶报告基因的原理基于荧光素酶（luciferase）的发光反应。
荧光素酶分为火焰荧光素酶（firefly luciferase，FLuc）和海蟑螂荧光素酶（Renilla luciferase，RLuc）两种。
FLuc是一种生物体内广泛存在的酶，能将底物D-荧光素磷酸酯（D-luciferin）氧化为产生黄绿色的荧光。
而RLuc则能将底物深海蟑螂荧光素酯（coelenterazine）氧化为产生蓝绿色的荧光。
双荧光素酶报告基因的主要用途是测定基因表达的活性。
在实验中，研究者将希望研究的基因启动子区域与荧光素酶报告基因FLuc或RLuc相连构建成转染载体。
接着，将该转染载体与内参基因载体同时转染至细胞中。
内参基因载体中含有RLuc基因，用于校正实验中的转染效率和细胞数的变化。
转染后，利用荧光素底物对FLuc和RLuc进行反应，测定二者的荧光强度。
通过确定FLuc和RLuc荧光强度的比值，可以消除转染效率和细胞数的影响，准确反映基因表达活性的变化。
双荧光素酶报告基因在生命科学中有着广泛的应用。
首先，在基因表达调控的研究中，双荧光素酶报告基因可以帮助研究者分析不同启动子的活性，揭示基因调控网络的机制。
此外，它还可以用于研究RNA干扰（RNAi）技术的效果，评估基因沉默的程度。
其次，双荧光素酶报告基因也被广泛应用于研究蛋白质相互作用。
通过将FLuc和RLuc融合到感兴趣的蛋白质上，可以实时监测蛋白质相互作用的强弱和时空分布。
此外，双荧光素酶报告基因还可以用于筛选药物分子，评估其对某一特定信号通路的影响。
未来，双荧光素酶报告基因技术还有许多发展方向。
双荧光素酶报告基因检测系统-promega
Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH0中，40C2保存（一个月）。
R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay BufferII 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。
3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-200C保存15天）。
（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。
重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。
pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。
具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。
1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因原理双荧光素酶报告基因是一种常用于生物学研究的工具，其原理是利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来检测基因表达水平和调控机制。
该系统包括火萤酶和甲基火萤酶两种酶，通过测量这两种酶的活性，可以对目标基因的表达进行定量分析。
下面将对双荧光素酶报告基因的原理进行详细介绍。
首先，双荧光素酶报告基因系统利用了两种不同的荧光素底物，火萤酶底物和甲基火萤酶底物。
在该系统中，火萤酶底物首先被加入到待检测的样品中，然后通过火萤酶的催化作用产生荧光素，发出强烈的黄绿色荧光。
接着，甲基火萤酶底物被加入到同一样品中，通过甲基火萤酶的催化作用产生荧光素，发出强烈的蓝色荧光。
这两种荧光素的发光强度可以分别被检测仪器所测定，从而实现对目标基因表达水平的准确测量。
其次，双荧光素酶报告基因系统还包括了内参基因的设计。
内参基因是一个稳定表达的基因，其表达水平不受外界因素的影响。
在双荧光素酶报告基因实验中，内参基因的存在可以帮助消除实验误差，使得实验结果更加可靠。
通常情况下，内参基因的表达水平会被用来对目标基因表达水平进行校正，从而得到更加准确的结果。
最后，双荧光素酶报告基因系统的原理还涉及到对基因调控机制的研究。
通过对目标基因表达水平的测量，可以进一步探究该基因在不同生物学过程中的调控机制。
例如，在转录因子的研究中，可以利用双荧光素酶报告基因系统来分析转录因子对目标基因的调控效应，从而揭示基因调控网络的复杂性。
总之，双荧光素酶报告基因系统是一种灵敏、准确的基因表达分析工具，其原理简单清晰，操作方便快捷。
通过对目标基因表达水平的测量，可以帮助科研人员深入了解基因的功能和调控机制，为生物学研究提供重要的技术支持。
希望本文对双荧光素酶报告基因的原理有所帮助，谢谢阅读！。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因（Dual-Luciferase Reporter Assay）是生物学研究中常用的一种技术手段。
它可以用来检测某一化合物或活性蛋白对于细胞转录因子的调控作用。
该技术是在双荧光素酶（firefly luciferase）和重组蛋白络合体荧光素酶（renilla luciferase）的基础上建立的。
先构建一个含有目标基因启动子和荧光素酶（firefly luciferase）基因的质粒，再构建一个含有重组蛋白启动子和重组蛋白络合体荧光素酶（renilla luciferase）基因的质粒。
将两个质粒转染到同一个细胞中，通过双荧光素酶和重组蛋白络合体荧光素酶的产生，实现基因的活性检测。
在进行活性检测时，首先利用生物化学试剂对双荧光素酶和重组蛋白络合体荧光素酶进行反应，生成发光信号。
通过测量这些发光信号的强度，可以了解转录因子在细胞内行使调控作用的效果。
如果转录因子的调控效果非常好，那么基因启动子中荧光素酶的表达就会升高，而重组蛋白启动子中的荧光素酶表达就会降低。
通过这种方法，可以很容易地分析不同条件下转录因子的作用效果，并进行评估。
同时也可以利用双荧光素酶和重组蛋白络合体荧光素酶的产生，比较不同化合物对基因的调控作用。
目前，技术已成为生物学研究中非常有用的分子生物学手段。
它可以帮助科学家们揭示细胞调控机理，解读基因表达调节的复杂性，促进药物筛选等方面的研究。
同时，由于技术原理简单、操作方便，技术被广泛应用于细胞生物学、生物化学、分子生物学等领域的研究。
总之，技术在生物学研究中有着广泛的应用前景。
它可以帮助科学家们更好地理解基因表达调控的机制，为疾病治疗和药物开发提供有力的支持。
双荧光素酶报告基因测定法
双荧光素酶报告基因测定法一、引言双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因测定法是一种常用的非侵入性转录物分析方法，广泛应用于研究基因表达调控、信号传导途径和转录因子激活等生物学过程。
双荧光素酶测定法结合了荧光素酶的双荧光素酶报告基因和育像蛋白的内参基因，通过检测这两种酶的活性比例来分析目标基因的表达水平及其受到的调控影响。
本实验旨在介绍双荧光素酶报告基因测定法的原理、实验步骤和数据分析方法，以及其在科研实验中的应用。
二、原理双荧光素酶报告基因测定法基于两种荧光素酶的差异表达，分别是火萤酶（LUC）和荧光素酶（RLUC）。
在实验中，双荧光素酶质粒将目标基因的启动子或响应元件与火萤酶基因和荧光素酶基因进行融合，构建成双荧光素酶报告基因表达载体。
通过质粒转染或病毒载体介导的基因递送，将双荧光素酶报告基因载体导入细胞内，使其表达成片段性。
当目标基因的启动子或响应元件被激活，通过蛋白质结合、酶诱导或信号通路激活等途径，可导致火萤酶表达增加。
而荧光素酶则作为内参基因，保持其在不受影响的状态下稳定表达。
在此情况下，通过双荧光素酶酶活体系检测细胞总表达情况下火萤酶和荧光素酶的活性比例，从而间接反映出目标基因的表达水平及受到的调控影响。
三、实验步骤（1）细胞培养和质粒转染细胞培养：选择适当的细胞系，并按照细胞培养的常规方法进行培养和传代。
质粒转染：将双荧光素酶报告基因表达载体转染至培养好的细胞中。
一般可采用化学方法如聚乙烯亚胺转染、磷酸钙法转染或电穿孔法转染等。
（2）激活实验将细胞转染后，配置相应的实验处理组和对照组。
对照组可以设置为空缺转染、阴性对照和阳性对照等。
实验处理：对照组和处理组分别按照实验方案进行处理。
如添加激活剂、抑制剂、基因过表达、RNA干扰等。
培养时间：培养细胞至接近稳态，通常培养时间为24-48h。
（3）细胞裂解和双荧光素酶活性检测裂解细胞：用裂解缓冲液加入到细胞培养瓶内，彻底裂解细胞并悬匀。
双荧光报告实验步骤
双荧光报告实验步骤：荧光步骤实验报告荧光酶报告实验植物写物理实验报告的步骤实验报告模板篇一：双荧光报告系统报告基因Promega中文通讯第2期2002荧光素酶双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因原理
介绍
双荧光素酶报告基因是一种常用于生物学研究的分子生物学工具。
通
过将双荧光素酶报告基因引入到目标细胞或组织中，可以实现对其内
部生化过程的研究和监测。
原理
双荧光素酶报告基因的原理是利用荧光素酶（Luciferase）对荧光素底物产生的发光反应进行检测。
在该反应中，荧光素底物与ATP在Luciferase的作用下发生氧化反应，生成氧化荧光素和二氧化碳，并
释放出大量能量，从而产生明亮的发光信号。
应用
1. 基因表达分析：通过将双荧光素酶报告基因与目标基因融合后转染
到细胞中，可以实现对该基因在不同条件下的表达情况进行定量检测。
2. 转录调控研究：通过构建含有转录调控元件的双荧光素酶报告质粒，并转染到细胞中，可以实现对该元件在不同条件下对转录的调控作用
进行研究。
3. 蛋白质相互作用研究：通过将双荧光素酶报告基因与目标蛋白质融
合后转染到细胞中，可以实现对该蛋白质与其他蛋白质相互作用情况
的研究。
4. 细胞信号通路研究：通过将双荧光素酶报告基因与目标信号通路相
关基因共同转染到细胞中，可以实现对该信号通路在不同条件下的活
性变化情况进行监测。
总结
双荧光素酶报告基因是一种重要的分子生物学工具，具有广泛的应用
价值。
通过其原理和应用，可以实现对生物体内部生化过程的深入研
究和监测。
双荧光素酶报告基因分析promega
双荧光素酶报告基因分析promega双荧光素酶报告基因分析1. 介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。
荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。
Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。
通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。
实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。
实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。
萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。
由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。
双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。
这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。
具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。
Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo?试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。
所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。
图 1－3 使用Promega 公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19 到1x10-11 mol)和海肾荧光素酶(1x10-14 mol)在Modulus?仪上测量结果。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因
第七节 筛
抗药性筛选：ampr tetr kanr 插入表达筛选: 蓝白斑筛选： 测序 菌落或噬菌斑杂交筛选 酶切鉴定：插入否？插入方向？
双荧光素酶报告基因
转染 ：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新 的遗传标志的过程 。 若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称 “瞬时转染(transient transfection)”； 若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制 称“稳定转染(stable transfection)”。
双荧光素酶报告基因
在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪切DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二
者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比乘客，车子把乘客送进理想天堂（
宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品 或开展基因治疗（IL2/L双A荧光K素→酶报抗告癌基因）。
注意事项： 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与 质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清 的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适 转染条件对于效率的提高有双荧巨光素大酶报的告作基因用。
报告基因活性的检测：
商业的试剂盒 报告基因发光检测仪
注意事项： 内参的一致性。
双荧光素酶报告基因
酶切注意事项（最好双酶切） 1. 酶的保存：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，
避免反复冻融。 2. 酶切反应体系：酶量不能超过反应体积的1/10。 3. 反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供。 4. DNA样品要求：一定纯度和浓度，不能混有酚、氯
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因是一种常用的测量基因转录活性的方法。
它可以通过荧光信号的读数来表达基因的表达程度，是许多实验室研究中使用的基础技术。
双荧光素酶报告基因的原理是基于荧光分子的性质。
荧光分子通常具有在电子能级间跃迁时吸收和放射光子的能力，因此它们可以被用来标记分子或触发荧光。
在双荧光素酶报告基因系统中，荧光分子通常被用于标记报告基因。
报告基因是那些包含可转录区域和调节元件的DNA序列，而荧光素酶报告基因特定于DNA序列。
因此，在实验中，荧光素酶基因被转染到体外细胞或植物细胞中，荧光分子会与其结合成荧光素酶复合物。
荧光素酶复合物在存在荧光素底物时催化荧光素底物转变为发射荧光的代谢产物，即荧光素。
这种发射荧光的信号可以通过荧光读数器进行测量。
因此，双荧光素酶报告基因的读数可以反映报告基因的表达程度。
这种方
法可以非常灵敏地检测基因表达的变化，可以用于判断基因表达
受到调控因素的影响。
当然，双荧光素酶报告基因技术也有其局限性。
一方面，由于
不同的细胞或组织内部环境的不同，荧光素酶的表达水平可能会
受到一些方面的影响，从而影响测量结果的准确性。
另一方面，双荧光素酶报告基因技术只能检测已经转录的基因，而无法检测可能受到转录后修饰的基因，或包含缺失或突变的基因。
因此，在进行实验前，需要对实验设计进行详细、系统的规
划和考虑。
综上所述，双荧光素酶报告基因技术是一种有效的基因表达检
测方法，广泛应用于生物医学和分子生物学的研究领域。
但是，
该技术的实验设计和数据分析需要谨慎地考虑其局限性和优缺点。
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SEAP（分泌性碱 性磷酸酶） CAT（氯霉素转乙 酰基酶） GFP（绿色荧光蛋 白）
•分泌性报告基因 (不需裂 解) -真核细胞没有背景表达 -易于使用 -设备现成(液闪仪,层析) •显微镜: 亚细胞定位 •不需底物
萤光素酶报告基因的主要优点
• • • • 非放射性 检测快（比CAT等） 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） 半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶 分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰 期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）
•细菌，血清等内源活性高 •需要底物
GUS（葡糖醛酸糖 苷酶）
•灵敏度好 •植物中内源活性低
• 90% 的 E.coli, 人／动物细胞中 有内源活性 •酶的扩散可引起 “过度报告” •需要底物
•在 HeLa , 癌 和其它细胞类型 中有高的内源活性 •需要底物 •放射性的 •灵敏度底 •50ｈ半衰期 •背景可能高 •折叠 “情形” 可导致信号差别
荧光计（Fluorometer）
液闪仪（Scintilation Counter） 电荷耦合装置光学成像系统 （CCD opitical imaging system）
荧光显微镜
各种报告基因的优点和缺点
报告基因 萤光素酶 优点
•优越的灵敏度 –高信号值 –无内源活性
•灵敏度好
缺点
•需要底物
ß-gal
0.76 0.71 0.79 0.74
第二天处理Ｃ计算如下：
1.00
１
２ ３
处理D
Δ 活性倍数 (791,021/19,154) =
41,30 55,81
（16,062/21,631)
1
2 3
14,865 19,3-05 8,967 12,284 13,767 20,246 12,533 17,278
Passive lysis buffer
Stop&Glo Reagent
DLRTM For HTS
DLR™双报告基因检测系统应用举例
α－黑色素刺激激素(α-MSH)对由人酪氨酸酶启动子／增 强子控制的萤光素酶的表达的诱导(Promega eNotes)
• 目的：监测细胞对α-MSH诱导的应答 • 材料： 实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子／增强子＋Luc(+) 阳性对照：pGL3-Control 阴性对照：pGL3-Basic 内对照：pRL-SV40 B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR ™双萤光素酶检测试剂盒
Renilla 萤光素酶载体系列
TK 启动子 hRL 基因 SV40 晚 poly(A)
phRL-TK(Int-)
三个读码框的 终止密码子
MCS
phRG-B
合成 poly(A) 信号 转录停止位点
三个读码框的 终止密码子
TK 启动子
phRG-TK
合成 poly(A) 信号 转录停止位点
用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因
pGL3-Enhancer Map
pGL3-Promoter Map
内对照载体可能存在的问题
辅助报告基因的相对萤光单位 (RLU)
启动子交叉交谈或互相干扰 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节
•
•
•
载体 - 海肾萤光素酶报告基因载体
第二代
phRL-null phRL-TK phRL-TK (int-) phRL-SV40 phRL-CMV phRG-B phRG-TK
Δ活性倍数
11.52 5.82
1 2 3
第二天 对照
(F/R)样品
=
113.21 57.18
F/R)对照
１ ２ •
处理Ｃ
15,529 20,433 21,897 30,841 10,760 13,620 16,062 21,631 850,239 578,951 943,873 791,021 20,843 14,830 21,788 19,154
Selective quench of firefly luminescence
Dual-Glo™萤光素酶检测系统
试剂盒组成 • • • • Dual-Glo™萤光素酶缓冲液 Dual-Glo™萤光素酶底物（冻干粉） Dual-Glo™Stop-Glo®缓冲液 Dual-Glo™Stop-Glo®底物
• 步骤
前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40 （分成两组） pGL3-Control 和 pRL-SV40 pGL3-Basic 和 pRL-SV40
裂解细胞，测量萤光
Dual-Glo™萤光素酶检测系统
检测特点 •均质检测，为高通量检测而设计
•萤光信号稳定，2hrs内检测
•自发萤光低于检测水平
Dual-Glo Assay: 同一样品中检测两种萤光信号
Cells in culture medium
Primary reporter: Firefly bioluminescence Add firefly assay reagent Secondary reporter: Renilla bioluminescence Add combination firefly quench reagent & Renilla assay reagent
• 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或Gal ,的两个报告基因的检测都灵敏而快速．
双萤光素酶报告基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照 的优点
• 速度
– 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内 完成
• 灵敏
– 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内 源萤光素酶背景极低
• 方便
１ ２ ３
处理Ａ
5,128 7,553 10,555 7,745
2,511 3,815 5,413 3,913
1.98
1.00
１ ２ ３
处理B
5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232 587,635 988,347 409,881 661,954 5,144 8,832 3,564 5,847
第一代
pRL-null pRL-TK pRL-SV40 pRL-CMV
Renilla 萤光素酶载体系列
MCS 内含子 hRL 基因 SV40 晚poly(A)
phRL-null
HSV TK 启动子
T7 启动子
phRL-TK
CMV即时早期增强子/启动子
phRL-CMV
SV40 早期 增强子/启动子
phRL-SV40
均质检测
发光
细胞+培养基
添加试剂
非均质检测
发光
细胞+培养基
除去培养基
清洗细胞
裂解细胞
添加试剂
Dual-Luciferase®报告基因检测系统组分
• • • • • 检测缓冲液II 底物（冻干粉） Stop&Glo®缓冲液 Stop&Glo®底物,50X 被动裂解液,5X
Dual-Luciferase®报告基因检测步骤
• 线形范围广 （在10-16 M(10pg/L)至10-8 M(1mg/L)范围内,光 强度与萤光素酶浓度成正比） • 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 (对多孔板而言) • 生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发 射器 • 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力
萤光素酶报告基因的使用
• 裂解细胞
– 被动裂解
• 除去培养基..PBS洗..加1XPLB, 振荡15分钟..检测
– 主动裂解
• 除去培养基..PBS洗..在1XPLB中刮下细胞..细胞转移到试 管或小瓶中..1-2次冻融..检测
• 检测
双萤光素酶检测方案
1 支试管 2 步检测 30 秒钟
Luciferase Assay Reagent II
操作步骤
• 试剂制备简单 – 将Dual-Glo™ 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo™ 萤 光素酶底物中 – 用Dual-Glo™ Stop &Glo® 缓冲液按1:100 稀释 Dual-Glo™ Stop &Glo® 底物 – 所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于 –20°C • 两步加入试剂: 加, 读, 加, 读 • >10,000 倍信号分离 (淬灭)
• Dual-Luciferase® 双萤光素酶报告基因系统（ 非均质检测）
– E1910，100次 – E1960，E1980，1000次
• Dual-GloTM 萤光素酶检测系统 （均质检测）
– E2920，10ml – E2940，100ml – EE2980，10X100ml
均质检测与非均质检测
= 55.81
0.73 0.99
GloMax ™ 20/20 Single tube luminometer
GloMax ™ 96 luminometer
White microplates for luminescence
Promega公司出品的双报告基因实验产品
• 质粒
– 萤火虫萤光素酶质粒 – 海肾萤光素酶质粒 – 叩头虫萤光素酶质粒
单体, 61,000 Daltons
ATP . Mg 2+
萤光素:
海肾萤光素酶反应
Coelenterazine + O2
萤光素酶: 萤光素: (Coelenterazine)
萤光素酶
Coelenteramide + CO2 + Light
单体, 36,000 Daltons