CRISPRCas9基因编辑技术简介 ppt课件
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CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
?crisprcas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰?crrna结合相关的cas蛋白后形成crrnacas蛋白复合体通过碱基互补配对精确地与目标dna相结合随后cas蛋白对目标dna进行断裂和降解
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
?crisprcas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰?crrna结合相关的cas蛋白后形成crrnacas蛋白复合体通过碱基互补配对精确地与目标dna相结合随后cas蛋白对目标dna进行断裂和降解
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
crispr cas9技术课件PPT
8
2.CRISPR/Cas9技术的缺点 1.脱靶效应
2021/3/10
7
CRISPR/技术的前景及优缺点
➢ 3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 ➢ 1.在基因敲除方面具有绝对的优势 ➢ 2.可以用于因单基因突变造成的遗传病治疗 ➢ 3.在家畜及农业育种方面带来新的基因编辑技术
2021/3/10
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重 新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。
➢ 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
➢ 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引 导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2021/3/10
3
CRISPR/cas9作用机理
1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在 的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列 作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基 因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔 序列整合到两个重复序列之间
《基因编辑新技术》课件
• 基因疾病的治疗 • - 临床案例：ADA - S C ID • 癌症治疗方案 • - CA R - T细胞治疗 • - 基因修复及监测
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因编辑在生物制造产业的应用
• 基因编辑在农业领域的应用 • 合成细胞的设计 • 其他应用
基因编辑伦理和风险
• 伦理问题 • - 人类胚胎基因编辑 • - 基因编辑后代问题 • 风险控制 • - 安全性问题 • - 环境问题 • 国际规范和政策
《基因编辑新技术》PPT课件
# 基因编辑新技术 ## 简介 1. 什么是基因编辑技术？ 2. 基因编辑技术的发展历程 3. 基因编辑技术的应用前景
基因编辑原理
• 基本原理 • 基因编辑方法 • - TA LEN • - CRISPR-Cas9 • - ZFN • 基因编辑过程介绍
基因编辑在医学上的应用
结论
• 基因编辑技术的优缺点 • 未来展望
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因编辑在生物制造产业的应用
• 基因编辑在农业领域的应用 • 合成细胞的设计 • 其他应用
基因编辑伦理和风险
• 伦理问题 • - 人类胚胎基因编辑 • - 基因编辑后代问题 • 风险控制 • - 安全性问题 • - 环境问题 • 国际规范和政策
《基因编辑新技术》PPT课件
# 基因编辑新技术 ## 简介 1. 什么是基因编辑技术？ 2. 基因编辑技术的发展历程 3. 基因编辑技术的应用前景
基因编辑原理
• 基本原理 • 基因编辑方法 • - TA LEN • - CRISPR-Cas9 • - ZFN • 基因编辑过程介绍
基因编辑在医学上的应用
结论
• 基因编辑技术的优缺点 • 未来展望
crisprcas基因编辑技术原理与应用ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
应用
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞 操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是 CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现 原理 应用 优点 缺点 发展 前景
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不 足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现 了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复 核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚 不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在 为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其 它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly
What
01
Clustered regularly interspaced
shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-
associated (Cas) systems
（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）
CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列， 02 而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、
应用
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物 模型、改良动物品系和研制动物反应器等。
细胞生物学CRISPR-CAS9 ppt课件
加拿大盖尔德纳奖
►诺奖风向标：在过去收到这个奖项的320位科学家中，有83位紧接着获得诺奖 ►今年获得该奖项的5位科学家全都来自一个领域：CRISPR-Cas9基因组定点编 辑技术。
加拿大盖尔德纳奖
►获奖理由：开发CRISPR-CAS用于真核细胞的基因编辑
Jennifer Doudna 、张锋、Emmanuelle Charpentier
专利之争
►2013年发表在《科学》杂志上的论文，成为CRISPR-Cas9真核细胞基因 编辑领域发表最早、被引用数量最多的论文之一。 ►张锋通过向专利局证明自己的实验记录而第一个得到相关专利。
专利之争
►“面对这项技术，不会有人轻易退出。站在双方背后的，除了各自的研
究所和大学，更有着数十亿的商业投资和运作。这场仍未有定式的专利纠 纷注定会成为一场旷日持久的争论，也许是一两年，也许更久。”
“ZFN提供了基因组编 辑技术的理论基础，但 TALEN做了ZFN的大部 分工作，且更便宜、更 快、更好。”
基因组编辑上的新生力量， 论文数量在5年间增长了5 倍。
CRISPR/Cas系统元件和特征
►CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复序列
►CRISPR/Cas系统由CRISPR序列元件与Cas基因家族组成
►sg-RNA：single guide RNA
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
Biology of the type II-A CRISPR-Cas system
CRISPRCas技术PPT课件
1 DNA，其中 HNH 结构域切割互补的 DNA 链，Ruv C 切割非互
补的 DNA 链。Cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。
CRISPR之间的间隔区转录成前体cr-RNA（pre-crRNA），
2 经核酸酶切割成熟，与tracr RNA结合成sgRNA，sgRNA具
有特异性，作用于特定的基因序列。
第1页/共26页
CONTENTS
一、CRISPR-Cas系统的简介
1，CRISPR/Cas系统的由来 2，CRISPR/Cas系统的分类 3，CRISPR/Cas系统的结构
二、CRISPR-Cas系统的作用机理
1，CRISPR间隔区的获得 2，crRNA的表达和成熟 3，外源基因的切割
三、DSB的修复 四、CRISPR-Cas系统的应用 五、CRISPR技术的脱靶问题 六、实验设计
第16页/共26页
第17页/共26页
基因敲出：如向受精卵中注射Cas9mRNA和 sgRNA、构建gRNA-Cas质粒结合非同源重组进 行基因的敲除。构建sgRNA进行基因组筛查和药物靶点的鉴 定。
基因表达调控：改造成转录激活因子、转录抑制 因子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9
第18页/共26页
➢ 制备高度转移的肿瘤单细胞悬液。 ➢ 用构建好的gRNA腺病毒转染肿瘤细胞。
➢ 在培养基中加入嘌呤毒素筛选出转染成功的 细胞。
➢ 裂解细胞提取质粒DNA。 ➢ 通过酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定。
第24页/共26页
实验过程
➢ 把构建好的reporter载体转染到筛选出来的肿 瘤细胞中，以reporter转染空肿瘤细胞做空白 对照。
第11页/共26页
前导区调控细菌CRISPR之间的间隔 区转录为前体crRNA，反式激活 cr RNA（tracr RNA）与 pre-cr RNA 重 复序列互补介导核酸酶 Rnase III 对 pre-cr RNA 进行加工处理，切割成 成熟crRNA。
补的 DNA 链。Cas9切割双链时无特异性，可作用于任何基因。
CRISPR之间的间隔区转录成前体cr-RNA（pre-crRNA），
2 经核酸酶切割成熟，与tracr RNA结合成sgRNA，sgRNA具
有特异性，作用于特定的基因序列。
第1页/共26页
CONTENTS
一、CRISPR-Cas系统的简介
1，CRISPR/Cas系统的由来 2，CRISPR/Cas系统的分类 3，CRISPR/Cas系统的结构
二、CRISPR-Cas系统的作用机理
1，CRISPR间隔区的获得 2，crRNA的表达和成熟 3，外源基因的切割
三、DSB的修复 四、CRISPR-Cas系统的应用 五、CRISPR技术的脱靶问题 六、实验设计
第16页/共26页
第17页/共26页
基因敲出：如向受精卵中注射Cas9mRNA和 sgRNA、构建gRNA-Cas质粒结合非同源重组进 行基因的敲除。构建sgRNA进行基因组筛查和药物靶点的鉴 定。
基因表达调控：改造成转录激活因子、转录抑制 因子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9
第18页/共26页
➢ 制备高度转移的肿瘤单细胞悬液。 ➢ 用构建好的gRNA腺病毒转染肿瘤细胞。
➢ 在培养基中加入嘌呤毒素筛选出转染成功的 细胞。
➢ 裂解细胞提取质粒DNA。 ➢ 通过酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定。
第24页/共26页
实验过程
➢ 把构建好的reporter载体转染到筛选出来的肿 瘤细胞中，以reporter转染空肿瘤细胞做空白 对照。
第11页/共26页
前导区调控细菌CRISPR之间的间隔 区转录为前体crRNA，反式激活 cr RNA（tracr RNA）与 pre-cr RNA 重 复序列互补介导核酸酶 Rnase III 对 pre-cr RNA 进行加工处理，切割成 成熟crRNA。
基因编辑技术比较CRISPR Cas9,casF,Cpf1 ppt
CRISPR-CPf1作用原理
cas9 / casF /cpF1总结
Part.4
Cpf1/Cas9比较
Cas9/ casF / Cpf1总结
谢谢观看
CRISPR：
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中 的特殊DNA重复序列家族，是成簇的规律间隔的短 回文重复序列。右图展示了完整的CRISPR位点的结 构。
CRISPR/cas9基因编辑原理
主要内容
crRNA ( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activatingRNA )结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。
CRISPR/cas9、casF、Cpf1 基因编辑技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
➢ 1. CRISPR/cas9基因编辑技术 ➢ 2. CRISPR/casF基因编辑技术 ➢ 3. CRISPR/cpF1基因编辑技术 ➢ 4. cas9 / casF /cpF1总结
CRISPR/cas9的基本原理
Part.1
CRISPR/cas9基因编辑原理
CRISPR/casF基因编辑技术
Part.2
CRISPR/ casF基因编辑技术
原理： casF能切割与crRNA互补的DNA，并且使用单个RuvC活 性位点进行pre-crRNA加工和切割。 casF分子量：cas9蛋白的一半 Cas蛋白结构域:HNH、RuvC 向导RNA：crRNA pre-crRNA加工方式：casF蛋白加工 DNA识别区：富含T的PAM 序列（5′TBN 3′，B是G、T或C） 优点：分子量小、对PAM区要求低，有利于基于载体向细胞内 递送和更广泛的可靶向基因组序列范围
《crisprcas9技术》课件
CRISPR-Cas9的应用
基因组编辑及修补
CRISPR-Cas9技术可以精确的定位基因组中特定位点 进行编辑和修补，是医学、农业、工业等领域中重 要的基因体系。
基因靶向表达
利用CRISPR-Cas9技术的靶向控制基因表达可以实现 治疗疾病、生产有用生物制品等应用。
基因调控
CRISPR-Cas9技术可选择性、有 Nhomakorabea地进行基因调控，
应用前景
• CRISPR-Cas9技术未来将 广泛用于医疗、农业、 工业、环保等领域，成 为生物技术创新的重要
• 推基动于C力R。ISPR-Cas9技术的 新产品、新技术、新应 用也将成为未来投资的 热点领域。
2
编辑系统的工作原理
CRISPR-Cas9通过识别、结合、切割目标基因位点，进一步实现对基因组的编辑 和修补，使基因组发生特定改变，达到治疗或改良目的。
3
PAM序列的特点
PAM序列指的是Cas9靶序列的附近序列，是单导RNA结合Cas9蛋白并定位于靶点 上的关键信息之一，其特点包括长度和序列的多样性。
农业遗传改良
利用CRISPR-Cas9技术对商业作物进行精准改良是未
CRISPR-Cas9技术的局限和挑战
1 异源物质的干扰
2 细胞外的嵌合酶
CRISPR-Cas9技术会受到外部异源物质的干扰， 影响其在目标细胞内的有效性。
CRISPR-Cas9技术需要有效的嵌合酶才能达到 预期效果，因此嵌合酶的研究一直是制约该 技术发展的瓶颈之一。
应用领域
CRISPR-Cas9技术已广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、疾病治疗和药物筛选等领域，且 应用前景广阔。
CRISPR-Cas9系统的构成和原理
CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介 ppt课件
2020/12/27
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
2020/12/27
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
2020/12/27
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4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
2020/12/27
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4.CRISPR/Cas9系统
2020/12/27
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4.CRISPR/Cas9系统
CRISPRCas基因编辑技术简介 ppt课件
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
高考生物一轮复习课件—CRISPRCas9技术
跟踪训练
CRISPR/Cas9 基 因 编 辑 技 术 中 ， sgRNA(单向导RNA)是根据靶基因 设 计 的 引 导 RNA ， 准 确 引 导 Cas9 切 割 与 sgRNA 配 对 的 靶 基 因 DNA 序列，CRISPR/Cas9系统进行基因 编辑时，对DNA序列中的原型间 隔序列相邻基序具有较高的编辑 效率，如图所示。回答下列问题：
跟踪训练
基因表达包括转录和翻译两个过 程，因此细菌Cas2基因表达Cas2 的过程需要细菌提供核糖核苷酸 和氨基酸等原料。由题意可知， Cas2和Cas9都能切割DNA，属于 限制性内切核酸酶(或限制酶)。 限制酶能切割DNA分子，催化磷 酸二酯键水解。
跟踪训练
(2)CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与 细菌体内的__cr_R_N__A__ 功能相同， 都可以与相应靶基因序列发生碱 基互补配对。细菌利用该防御机 制可以有效抵抗噬菌体的二次入 侵，但是仍然会有部分噬菌体能 够继续侵染已经获得免疫能力的 宿主菌，原因可能是__噬__菌__体__D_N__A_中__的__原__型__间__隔__序__列__发__生__基__因__突__变__，__导___ _致__C_R_I_S_P_R__位__点__形__成__的__cr_R_N__A_无__法__对__其__进__行__识__别___。
跟踪训练
CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA 是根据靶基因设计的向导RNA，能准 确 引 导 Cas9 切 割 与 sgRNA 配 对 的 靶 基 因DNA序列。 Cas9能借助向导RNA与 目标DNA进行精确定位的原因在于向导RNA上的碱基序列与目标DNA分 子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现向导RNA与目标DNA分 子特定序列的特定识别，进而定位；对目标位点的切割则依赖于Cas9蛋白 的专一识别，Cas9蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点剪切特定的碱 基序列，使磷酸二酯键断裂。
CRISPR基因编辑技术ppt课件
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
23
CRISPR/Cas 9作用机理
24
CRISPR/Cas 9作用机理
PAM（NGG序列） 25
CRISPR/Cas 9系统靶向要求
最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。在人 类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。
26
CRISPR/Cas 9基因编辑实验流程图
• NI可以识别A
• NN可以识别G或A
通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组
装在一起，就可以构成可以识别目的片
段的Tale蛋白。Fra bibliotek13TALEN原理
TALEN的特异性打靶的原理：
一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域； 然后非特异性核酸内切酶 FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（doublestrand break，DSB）； 再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。 FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。
30
CRISPR/Cas 9系统的优势
操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列 必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA 的序 列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便， 用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。 CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修 饰可遗传。 基因修饰率高，CRISPRs基因敲入的效率为51%-79%， TALENs的效率为0%-34%。 基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 无物种限制,可实现对靶基因多个位点同时敲除。 实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。(ZFNS 一个靶点成本6000＄)
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Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
2020/11/29
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4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著 名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、 小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
2020/11/29
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4.CRISPR/Cas9系统
形成crRNA-Cas蛋白复合体，
通过碱基互补配对精确地
与目标DNA相结合，随后
Cas蛋白对目标DNA 进行断
裂202和0/1降1/29解。
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4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
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1.CRISPR/Cas系统概述
1.2CRISPR系统获得：
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系 统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白 进行切割，从而达到对自身的免疫。
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
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Hale Waihona Puke 4.CRISPR/Cas9系统
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4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因敲除或者敲入； 基因修复； 基因调控； 筛选。2020/11/29
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5.CRISPR/Cas9 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
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3.CRISPR/Cas9系统作用机制
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后，
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
基因编辑技术CRISPR/Cas9
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1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
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1.CRISPR/Cas系统概述
1.1CRISPR的分布与分类：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒 中至少存在CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分 为3中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统 需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9 免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是 被改造的最成功的人工核酸内切酶。
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.3Cas家族：
Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链 DNA核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与 fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
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Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
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4.CRISPR/Cas9系统
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4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: E-CRISPR: ZiFiT: Cas9 Design: /index.jsp Cas-OFFinder: CCTop:
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4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著 名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、 小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
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4.CRISPR/Cas9系统
形成crRNA-Cas蛋白复合体，
通过碱基互补配对精确地
与目标DNA相结合，随后
Cas蛋白对目标DNA 进行断
裂202和0/1降1/29解。
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4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
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1.CRISPR/Cas系统概述
1.2CRISPR系统获得：
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系 统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白 进行切割，从而达到对自身的免疫。
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
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Hale Waihona Puke 4.CRISPR/Cas9系统
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4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因敲除或者敲入； 基因修复； 基因调控； 筛选。2020/11/29
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5.CRISPR/Cas9 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
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3.CRISPR/Cas9系统作用机制
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后，
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
基因编辑技术CRISPR/Cas9
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1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
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1.CRISPR/Cas系统概述
1.1CRISPR的分布与分类：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒 中至少存在CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分 为3中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统 需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9 免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是 被改造的最成功的人工核酸内切酶。
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.3Cas家族：
Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链 DNA核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与 fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2020/11/29
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
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4.CRISPR/Cas9系统
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4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: E-CRISPR: ZiFiT: Cas9 Design: /index.jsp Cas-OFFinder: CCTop: