筛选含有目的基因的受体细胞的方法
高中生物基因工程知识点总结
高中生物基因工程知识点总结基因工程是现代生物技术的核心内容之一，在高中生物学习中占据着重要的地位。
下面我们就来详细总结一下高中生物基因工程的相关知识点。
一、基因工程的概念基因工程，又称为基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
二、基因工程的基本工具1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）限制酶能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
2、“分子缝合针”——DNA 连接酶根据来源不同，DNA 连接酶分为两类：E·coli DNA 连接酶和T4DNA 连接酶。
E·coli DNA 连接酶只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而 T4DNA 连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。
3、“分子运输车”——载体常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
作为载体，需要具备以下条件：（1）能够在受体细胞中稳定保存并自我复制。
（2）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
（3）具有标记基因，便于进行筛选。
三、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取（1）从基因文库中获取基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA 文库）。
（2）利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。
（3）通过化学方法人工合成如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
2、基因表达载体的构建（基因工程的核心）目的基因、启动子、终止子、标记基因等组成基因表达载体。
启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出 mRNA；终止子终止转录；标记基因用于鉴别和筛选含有目的基因的细胞。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
高中生物2019人教版基因工程 重点知识无废话
基因工程知识清单基因工程：通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
又叫做DNA重组技术。
操作水平：DNA分子水平原理：基因重组1.1 基本工具“分子手术刀”—限制性内切核酸酶（限制酶）“分子缝合针”—DNA连接酶“分子运输车”—载体1、限制酶：限制酶存在于原核生物中的作用：切割进入细胞的外源DNA，有助于抵抗病毒的侵染。
限制酶不切割原核细胞自身DNA的原因：不存在能被识别的特定序列，或相关序列已被修饰，无法识别。
（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）功能：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，断开特定部位的磷酸二酯键，具有专一性（特异性）。
（3）结果：产生黏性末端或平末端。
2、DNA连接酶：DNA连接酶与DNA聚合酶的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，二者均作用于磷酸二酯键。
3、载体（1）载体必备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因。
（2）质粒：最常用的载体，裸露的、结构简单的、独立于细菌染拟核之外或真核细胞细胞核之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体：噬菌体、动植物病毒4.DNA 的粗提取与鉴定1. 粗体取原理: ①DNA 不溶于酒精, 某些蛋白质溶于酒精。
（需要使用预冷的酒精溶液）②DNA 能溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液。
2.DNA鉴定原理：DNA 遇二苯胺试剂在沸水加热条件下会呈现蓝色。
1.2 基本操作程序操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建（核心步骤）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
第一步：目的基因的筛选与获取1.目的基因的筛选方法：从已知结构功能清晰的基因中进行筛选2.目的基因的获取方法：人工合成、PCR技术、从基因文库中获取PCR技术（聚合酶链式反应）（1）原理：DNA半保留复制（2）过程：①变性——90℃双链DNA断开氢键，解聚为单链；②复性——50℃，引物通过碱基互补配对结合到互补单链；③延伸——72℃，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
基因工程的原理和技术
基因工程的基本原理：
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细 胞中稳定和高效的表达。根据不同的实验目的，目 的基因可以有很多种，如抗虫基因、抗病基因、抗 除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。因 此表达的产物各不相同。通过基因工程的基本操作 ，就能实现目标。
二、基因操作的基本步骤
第三步：将目的基因导入受体细胞
选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：
基因工程的 最终目的
得到大量特 殊蛋白质
得到转基因动物 得到转基因植物
常用的受 体细胞
大肠杆菌 等微生物
受精卵 植物体细胞
导入的方法
Ca2＋处理法 显微注射法 农杆菌转化法
将目的基因导入微生物细胞
常选细菌 作受体细胞的原因：它 们繁殖力极强，生长速 度很快，短期内就会产 生大量后代，所以把目 的基因转入这些细菌， 就能在短时间内得到大 量的目的基因产物。
细菌的检测：
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的 菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
多细胞生物的检测： 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体， 检测这些个体是否表现出相应的性状。
例：抗虫棉检测
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不 出现中毒症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。
例：下列有关基因表达载体的构建说法正确的是( C ) A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子 B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性 核酸内切酶 C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来 源的DNA重新组合的过程 D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处， 先形成磷酸二酯键，再形成氢键
高中生物专题1基因工程1.2第2课时将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定教案高二生物教案
第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定[学习目标] 1.熟悉目的基因导入受体细胞的方法。
2.了解农杆菌转化法。
3.画出DNA 分子杂交示意图。
4.目的基因的检测方法的比较。
知识点一 将目的基因导入受体细胞知识梳理1.转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内□01维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入植物细胞(1)□01农杆菌转化法：将目的基因导入□02双子叶植物和裸子植物最常用的方法 ①农杆菌特点：当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的□03酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的□04Ti 质料上的T －DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的□05DNA 上。
②受体细胞：植物□06体细胞或受精卵。
③操作过程：将目的基因插入到□07Ti 质粒的TDNA 上―→转入□08农杆菌―→导入□09植物细胞―→目的基因整合到□10受体细胞染色体的DNA 上―→目的基因表达。
(2)基因枪法：适用于□11单子叶植物，成本较高。
是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的□12表达载体DNA 打入受体细胞中，使目的基因与其整合并□13表达的方法。
(3)花粉管通道法：我国科学家独创的方法花粉管通道法，就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去□14柱头；然后，滴加□15DNA(含目的基因)，使目的基因借助□16花粉管通道进入受体细胞。
该方法十分简单经济。
我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。
3．将目的基因导入动物细胞(1)方法：□01显微注射技术，采用最多、最有效的方法。
(2)受体细胞：动物的□02受精卵。
(3)操作过程：将含有□03目的基因的表达载体提纯―→取卵(□04受精卵)―→□05显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，□06移植到雌性动物的□07输卵管或子宫内―→获得□08新性状的动物。
4．将目的基因导入微生物细胞(1)方法01Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细①用□胞称为□02感受态细胞)。
基因工程的应用(同步检测)2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3(含解析)
3.3 基因工程的应用（同步检测）一、单选题1．大豆为严格的自花传粉、闭花授粉植物。
我国是世界主要的大豆进口国家之一，大豆的产量低是一个重要的瓶颈。
下列说法错误的是（）A．我国丰富的大豆种质资源为大豆杂交育种提供了丰富的基因库B．通过培育大豆多倍体来育种是提高其产量的最合适途径C．大豆杂交育种与基因工程育种的原理都属于基因重组D．自然界中的大豆往往都是纯种，大豆间难以自然实现杂交2．我国的科研团队首次发现了高粱细胞中A T1基因编码的A T1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，对于提高作物在盐碱地的存活率具有重要意义。
在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2．图中的PIP2s为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输，其机理如图所示。
下列叙述错误的是（）A．盐碱环境可引起大多数作物胞内液渗透压上升，吸水能力增强B．PIP2s失活的植物细胞在高渗溶液中仍可以发生质壁分离C．敲除AT1基因将导致PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排D．可以将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性3．作物育种可以说是农业的“芯片工程”，下列关于育种的叙述，错误的是（）A．单倍体育种和多倍体育种分别是为了获得单倍体和多倍体新物种B．用化学阻断剂阻止受精后的次级卵母细胞释放极体（n），然后培育形成的最可能是三倍体C．转基因育种和杂交育种的主要原理都是基因重组D．植物体细胞杂交和秋水仙素处理都能实现植物不育向可育的转变4．科学家将蜘蛛的蛛丝蛋白基因导入山羊体内，得到转基因山羊，使羊奶中含有一种独特的蛛丝蛋白，生产原理见下图。
下列叙述错误的是（）A．图中的核供体细胞来自雌羊B．导入了蛛丝蛋白基因的核供体细胞不需要进行传代培养C．形成重组细胞时来自核供体细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换D．为获得更多转基因山羊，可对早期胚胎进行胚胎分割5．科学家运用基因工程技术，将人凝血因子基因导入山羊的DNA中，培育出羊乳腺生物反应器，使羊乳汁中含有人凝血因子。
课时作业36 基因工程(含答案详解)
因进入酵母菌细胞内，并且在其细胞内维持稳定和表达的过程，称为 转化 。在
表达过程中，启动子需与 RNA 聚合酶 识别和结合，从而驱动转录过程。
(3)在体液免疫过程中，白细胞介素是由 T 淋巴 细胞分泌的，为了能成功
表达出白细胞介素，不使用细菌，而使用酵母菌细胞作为受体细胞，可能原因
是 细菌细胞中无内质网和高尔基体等加工白细胞介素的细胞器
据图回答下列问题：
(1)在该实验中为构建基因表达载体，用 Sac Ⅰ、Xba Ⅰ切下 CBFl 基因后，对质 粒载体进行切割的限制酶是 Sac Ⅰ、Xba Ⅰ ，理由是 用 相 同 限 制 酶 切 割 来
源不同的 DNA 后，可产生相同的末端
。
(2) 连 接 CBFl 基 因 到 该 质 粒 载 体 后 ， 作 为 基 因 表 达 载 体 的 组 成 还 必 须 有 启动子和终止子 。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是 农杆菌转化法 。
6．(2021·河南洛阳联考)回答下列与基因工程相关的问题： (1)自然界中原核生物容易受到外源 DNA 的入侵，但依然可以达到保护自身的目 的，这为人们寻找 限制酶 (答基因工程的操作工具)提供了启示。质粒作为基因 工程的载体，应具备的基本条件：能够自我复制、具有标记基因和一个至多 个 限制酶切割位点 。 (2)利用 PCR 技术扩增蜘蛛丝基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计 2 种引 物，进行 PCR 时需加热至 90～95 ℃，然后冷却至 55～60 ℃，此操作的目的 是 将 DNA 解链，然后使引物结合到互补 DNA 链上 。
解析：本题考查基因工程的有关知识。根据“八氢番茄红素合酶(其基因用 psy 表示) 和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用 crtl 表示)参与 β－胡萝卜素的合成”可知，重组质粒中的 目的基因含有 psy 和 crtl，A 正确；构建重组质粒需要限制酶、DNA 连接酶，不需要核酸 酶，B 错误；可通过基因枪法、花粉管通道法将目的基因导入水稻受体细胞，C 错误；PCR 技术可扩增特定基因，但要检测目的基因是否表达应该用抗原—抗体杂交法，D 错误。
基因工程的原理和技术
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第一章 第二节
学习要求
基本要求
1.概述述基因工程的原理2.概述基因工程基本操作的几个步骤
发展要求
举例说出筛选含有目的基因的受体细胞的原理
说明
“课外读：聚合酶链式反应（PCR）”、“小资料：基因工程的受体细胞”只作为背景材料阅读，不要求记忆或掌握具体的内容。
PCR技术
延伸
单，导入到受体菌的群体中，各个受内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制性核酸内切酶
与载体连接 导入
某种生物某个时期的mRNA
cDNA
反转录
受体菌群体
与载体连接 导入
三、目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
三、目的基因导入受体细胞
例如，用质粒作为载体，宿主细胞应该选择大肠杆菌。
将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。基因组部分基因 （cDNA）
二、形成重组ＤＮＡ分子
添加标题
用一定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。
添加标题
用同一种限制性核酸内切酶切断目的基因，使其产生相同的粘性末端。
添加标题
用DNA连接酶将切下的目的基因片段和载体ＤＮＡ形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
基因工程的基本操作步骤
获取目的基因 形成重组DNA分子 将重组DNA分子导入受体细胞 筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因的表达
筛选含有目的基因的受体细胞的方法
基因工程中重组DNA的两次筛选张辉运江西省遂川中学基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA 片段有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状DNA。
这些环状DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。
如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。
【例】图1是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。
【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。
如图2所示本题中所选用的质粒A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。
在进行导入操作中，质粒自连的环状DNA和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基因自连环状DNA则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有3种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。
第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。
第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图3D）的平板上印一下。
基因工程经典例题
基因工程经典例题解析一、例题1（一）题目已知一种限制酶能识别DNA分子中的GAATTC序列，并在G和A之间进行切割。
现有一段DNA分子序列为：- 5’—GGATCCGAATTCCTTAAG—3’- 3’—CCTAGGCTTAAGGAATTC—5’若用该限制酶对其进行切割，会产生几个黏性末端？这些黏性末端的碱基序列是什么？（二）解析1. 识别切割位点：-该限制酶识别GAATTC序列，在DNA分子中有两处该序列，分别是5’—GGATCCGAATTCCTTAAG—3’中的GAATTC和3’—CCTAGGCTTAAGGAATTC—5’中的GAATTC（注意DNA两条链的反向平行关系）。
2. 切割产生黏性末端：-在G和A之间切割后，产生的黏性末端为：- 5’—G AATTC—3’- 3’—CTTAA G—5’- 5’—CTTAA G—3’- 3’—G AATTC—5’-共4个黏性末端，碱基序列分别是5’—G AATTC—3’和5’—CTTAA G—3’（另两条链的反向互补序列与之相同，只是方向相反）。
二、例题2（一）题目在基因工程中，将目的基因导入受体细胞是一个关键步骤。
现有以下几种受体细胞类型：植物细胞、动物细胞、大肠杆菌细胞。
若目的基因是一种编码胰岛素的基因，应选择哪种受体细胞最为合适？为什么？（二）解析1. 分析受体细胞特点：-植物细胞：可以通过农杆菌转化法、基因枪法等方法导入目的基因，但植物细胞中没有胰岛素加工的相关内质网、高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行正确的加工和分泌。
-动物细胞：具有内质网、高尔基体等细胞器，能够对胰岛素进行正确的加工和分泌，适合胰岛素基因的表达。
-大肠杆菌细胞：是原核细胞，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行糖基化等加工，且胰岛素基因中可能含有大肠杆菌不能识别的密码子等，表达出的胰岛素可能没有活性。
2. 得出结论：-应选择动物细胞作为受体细胞最为合适，因为它能对胰岛素进行正确的加工和分泌，使胰岛素具有生物活性。
生物工程概论复习题
第二章《基因工程》复习题一、选择题1. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是（D）A 修复自身的遗传缺陷B 促进自身的基因重组C 强化自身的核酸代谢D 提高自身的防御能力2.生物工程的上游技术是（D）A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及细胞工程D 基因工程及蛋白质工程3. 基因工程操作的三大基本元件是:(I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体) （A）A. I + II + IIIB. I + III + IVC. II + III + IVD. II + IV + V4. 多聚接头（ Polylinker ）指的是（A）A. 含有多种限制性内切酶识别及切割顺序的人工 DNA 片段B. 含有多种复制起始区的人工 DNA 片段C. 含有多种 SD 顺序的人工 DNA 片段D. 含有多种启动基因的人工 DNA 片段5.下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是（D）A. GAAACTGCTTTGACB. GAAACTGGAAACTGC. GAAACTGGTCAAAGD. GAAACTGCAGTTTC6. 若将含有 5' 末端 4 碱基突出的外源 DNA 片段插入到含有 3' 末端 4 碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是（D）I T 4 -DNA 聚合酶 II Klenow III T 4 -DNA 连接酶 IV 碱性磷酸单酯酶A. IIIB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III7.下列有关连接反应的叙述，错误的是（A）A. 连接反应的最佳温度为 37 ℃B. 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C. 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD. 连接酶通常应过量 2-5 倍8. T4-DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是（D）A. 2' -OH 和 5' –PB. 2' -OH 和 3' -PC. 3' -OH 和 5' –PD. 5' -OH 和 3' -P9. 载体的功能是(I 运送外源基因高效进入受体细胞 II 为外源基因提供复制能力 III 为外源基因提供整合能力) （D）A. IB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III10.克隆菌扩增的目的是 (I 增殖外源基因拷贝 II 表达标记基因 III 表达外源基因) （D）A. I + IIB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III11. 下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是（C）A. 大肠杆菌－繁殖迅速B. 枯草杆菌－分泌机制健全C. 链霉菌－遗传稳定D. 酵母菌－表达产物具有真核性12.考斯质粒（cosmid）是一种（B）A. 天然质粒载体B. 由λ -DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体C. 具有溶原性质的载体D. 能在受体细胞内复制并包装的载体13. 某一重组 DNA （ 6.2 kb ）的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。
基因工程的原理和技术
2、形成重组DNA分子
限制性核酸 ①用一定的_________切割 内切酶 质粒，使其出现一个切 粘性末端 口，露出____________ 。 同一种限制性核酸内切酶 ②用_____________切割 含目的基因的DNA ，使其产生_____ 相同 的粘性末端 ____________。
切口 处， ③将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ，形成了一个重组 再加入适量___________ DNA分子（重组质粒）
农杆菌转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，农杆 菌中细胞中含有Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过 侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物染色体 中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农 杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过植物组织培养技术，再生出转基因植株。
5、目的基因的表达
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 检测 方法—— DNA分子杂交（DNA探针） （分子水平） ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 个体水平 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
程的叙述中，错误的是 （ A ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶
2．有关基因工程的叙述正确的是
(
D
)
A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可以作为运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
第一章
第二节
基因工程
基因工程的原理和技术
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
《基因工程》 第七章 重组子选择筛选与分析
第十八页，共四十四页。
③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能修饰Kn的 酶，阻碍Kn对核糖体的干扰(gānrǎo)。 四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变细菌膜的蛋白， 防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。
⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能修 饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
第三页，共四十四页。
1．根据载体选择标记初步筛选转化子
载体DNA分子上通常携带了一定的选择遗传标记基因，可进行转化 子或重组子初步筛选。做法(zuòfǎ)是将转化处理后的菌液（包括对照处理） 适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察 菌落生长情况，即可挑选出转化子。
对于受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB 培养基中加入适量的某种 选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因 所决定。
3) Immunological screening for expressed genes (Western blotting)
4) Analysis of cloned genes (Restriction mapping, DNA sequencing)
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第二页，共四十四页。
第一节 转基因筛选(shāixuǎn)和选择的方法
（1）抗药性筛选法 （2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法
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（1）抗药性筛选
这是利用载体DNA分子上的抗药性筛选标记进行筛选的方法。主要用于 重组质粒DNA分子的转化子筛选。重组质粒DNA分子携带特定的抗药性 选择标记基因，在含有相应选择药物的选择培养基上正常生长。 ① 氨苄青霉素（ampicillin，Ap 或Amp）: 含bla基因的菌体能转译 -丙酰胺酶 (-lactarnase)，可降解Ap。 ② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯霉素乙酰 转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化而失效。
高中生物选修三《基因工程》单元测试题(含答案)
专题1 《基因工程》单元测试题一、单选题(每小题只有一个正确答案)1.在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是( )A．限制酶和DNA连接酶B．限制酶和水解酶C．限制酶和载体D． DNA连接酶和载体2.下列说法正确的是( )A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B．用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组DNA导入受体细菌C．质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的载体D．利用载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程不能称为“克隆”3.某研究小组为了研制预防禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作。
其简要的操作流程如下图。
下列有关叙述错误的是( )A．步骤①所代表的过程是反转录B．步骤②需使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶C．步骤③可用CaCl2处理大肠杆菌，使其从感受态恢复到常态D．检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原—抗体特异性反应试验4.与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是( )A．反转录酶B． RNA聚合酶C． DNA连接酶D．解旋酶5.转基因抗虫棉的研制过程中，为了检测抗虫基因是否成功导入，最简捷有效的方法是( )A．用DNA探针检测受体细胞中的目的基因是否存在B．用DNA探针检测受体细胞中的目的基因是否转录出相应的mRNAC．直接将培育出的棉株叶片饲喂原本的棉花害虫D．检测标记基因是否正常地表达出来6.下列哪项不是表达载体所必需的组成( )A．目的基因B．启动子C．终止子D．抗青霉素基因7.下列说法正确的是( )A．限制性核酸内切酶的识别序列是GAATTC，只能在G和A之间切断DNAB． DNA连接酶能够将任意2个DNA片段连接在一起C．质粒是能够自主复制的小型双链环状DNA分子D．基因工程的载体只有质粒一种8.应用生物工程技术培育人们需要的生物新品种或新产品，提高了经济效益。
下图表示培育生物新品种的过程，请据图判断下列叙述中不正确的是( )A．图中①～⑤过程中都发生了碱基互补配对现象B．图中①过程需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶C．将PrG导入细胞Ⅱ，则Ⅱ最可能是浆B细胞D．图中⑤过程需要的培养基中一定含有植物激素和无机养料9.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是( )A．化学合成法B．基因组文库法C． cDNA文库法D．多聚酶链式反应10.中国新闻网报道，阿根廷科学家近日培育出了世界上第一头携带有两个人类基因的牛，因此有望生产出和人类母乳极其类似的奶制品。
筛选含有目的基因的受体细胞的方法
基因工程中重组DNA的两次筛选张辉运江西省遂川中学基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA片段有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状DNA。
这些环状DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。
如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。
【例】图1是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。
【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。
如图2所示本题中所选用的质粒A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。
在进行导入操作中，质粒自连的环状DNA和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基因自连环状DNA则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有3种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。
第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。
第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图3D）的平板上印一下。
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基因工程中重组DNA的两次筛选
张辉运江西省遂川中学
基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA片段有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状DNA。
这些环状DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。
如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。
【例】图1是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）
A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。
【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。
如图2所示本题中所选用的质粒A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。
在进行导入操作中，质粒自连的环状DNA和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基
因自连环状DNA则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有3种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。
第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。
第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图3D）的平板上印一下。
这样，由于重组质粒的抗四环素基因被目的基因破坏，不能形成菌落的即为含有重组质粒的受体细胞，根据对比（如图3C和D所示），就能在母板的培养基上筛选出含有目的基因的受体细胞。
【答案】C。