第七章基因工程菌苗

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基因工程思考题

《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。

2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。

4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。

8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。

基因工程菌培养 ppt课件

基因工程菌培养
5
基因工程菌发酵的设备
气升式发酵罐的优点：结构简单，不易污染，能耗低，操作简单，低剪切力, 适合高浓度发酵。基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）
基因工程菌培养
6
基因工程菌的高密度发酵
在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产物的表达都是在对数期内完成的，因此，发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌的对数生长时间，缩短衰亡时间
酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。
比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ /Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍
基因工程菌培养
9
培养方式
分批补料培养方式补充营养稀释代谢产物
基因工程菌培养
基因工程菌培养
1
什么是基因工程菌？
为什么要构建基因工程菌？遗传性状的改良代谢途径的加工生物反应器
基因工程菌培养
2
基因工程菌的构建
宿主菌：大肠杆菌
作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济, 是应用最广泛,最成功的表达体系
宿主对质粒稳定的影响质粒拷贝数重组质粒的表达对质粒稳定性的影响培养条件的影响（培养基，温度，pH等等）
基因工程菌培养
20
稳定基因工程菌的措施
改进重组质粒的结构选择适当宿主增加外界环境压力调节培养条件
基因工程菌培养
21
施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中
分离与培养耦合固定化培养技术
固定化技术与连续培养，透析培养相结合是基因工程菌发酵的发展方向

微生物自测习题

第一章一、选择题1.E. coli肽聚糖双糖亚单位交联间的肽间桥为：（ B ）A.氢键B.肽键C.甘氨酸五肽2.Staphylococcus aureus肽聚糖双糖亚单位交联间的肽间桥为：（ B ）A.肽键B.甘氨酸五肽C.氢键3.细菌细胞中的P素贮藏颗粒是：（ D ）A.羧酶体B.淀粉粒C.聚-β-羟基丁酸D.异染粒4.细菌的细胞核是：（ A ）A.裸露的DNA分子B.DNA与组蛋白结合的无核膜包围的染色体C.RNA与组蛋白结合的无核膜包围的染色体5.在细菌细胞中能量代谢场所是( A )A.细胞膜B.线粒体C.核蛋白体D.质粒6.细菌的鞭毛是( B )A.细菌运动的唯一器官B.细菌的一种运动器官C.细菌的一种交配器官D.细菌的繁殖器官7.放线菌的菌体呈分枝丝状体,因此它是一种（C ）A.多细胞的真核微生物B.单细胞真核微生物C.多核的原核微生物D.无壁的原核微生物8.在下列原核生物分类中,属古细菌类的细菌是( D )A.大肠杆菌B.枝原体C.放线菌D.产甲烷细菌9.枝原体的细胞特点是( C )A.去除细胞壁后的细菌B.有细胞壁的原核微生物C.无细胞壁的原核微生物D.呈分枝丝状体的原核微生物10.蓝细菌中进行光合作用场所是（ A ）A.类囊体B.羧酶体C.异形胞11.下列微生物中能通过细菌滤器，并营专性寄生的是（ C ）A.苏云金杆菌B.蛭弧菌C.衣原体D.支原体二、填空题1.脂多糖(LPS)是革兰氏菌细胞壁层的主要成分，它由，，三部分构成.2.G-细菌细胞壁分层，其化学成分有, ，，.3.在革兰氏阳性细菌细胞壁的肽聚糖成分中，肽包括和两种，聚糖则包括和两种糖.4.肽聚糖中的双糖是由键连接的，它可被水解，从而形成无细胞壁的原生质体.5.革兰氏阳性细菌的四肽尾是由、、_和四种氨基酸连接而成，而革兰氏阴性细菌的四肽尾则是由、、和四种氨基酸连接而成.6.磷壁酸是革兰氏性细菌细胞壁上的特有成分，主要成分为或.7.异染粒是细菌元素的储存形式.8.放线菌个体为菌丝体，根据菌丝在固体培养基上生长的情况，可以分为基内菌丝，气生菌丝和孢子丝.9.蓝细菌亦称蓝藻，其一般直径或宽度为3~10um，有时在水池，湖泊繁殖盛，形成肉眼可见的较大群体，常称之水华而导致水污染和水生动物的死亡.三、判断题1.磷壁酸只存在于革兰氏阳性细菌的细胞壁中.( + )2.因为细胞壁是细菌的一般构造，故细菌都有细胞壁.( +)3.鞭毛是细菌的运动器官，蓝细菌因生鞭毛而运动.( - )(蓝细菌无鞭毛,靠滑行运动)4.质粒与染色DNA一样，失去质粒，细菌细胞就会死亡.( - )5.细菌的芽孢只能由杆菌产生，细菌一旦形成芽胞后，不具有运动和繁殖的能力.( - )(芽孢与运动无关)6.链霉菌是霉菌，其有性繁殖形成接合孢子.( - )(放线菌)7.放线菌具有菌丝，并以孢子进行繁殖，它属于真核微生物.( - )四、简答题1.试图示G+细菌和G-细菌细胞壁的主要构造，并简要说明其异同.第二章一、选择题1.指出错误的回答,真核微生物包括有( C )A.真菌B.粘菌C.枝原体D.原生动物2.在真核微生物的“9+2”鞭毛中，具有ATP酶功能的构造是（ D ）A.微管二联体B.中央微管C.放射辐条D.动力蛋白壁3.酵母菌细胞壁中含有（ C ）A.甘露聚糖B.葡聚糖C.A和BD.几丁质4.酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的无性繁殖是（ B ）A.裂殖B.芽殖C.假菌丝繁殖D.子囊孢子繁殖5.啤酒酵母菌的生活史属( C )A.单倍体型B.双倍体型C.单双倍体型D.双核体型6.构成丝状真菌营养体的基本单位是（ A ）A.菌丝B.菌丝体C.无隔菌丝D.有隔菌丝7.锁状联合是担子菌（ D ）的生长方式.A.双核的初生菌丝B.单核的初生菌丝C.单核的次生菌丝D.双核的次生菌丝8.指出错误的回答,真菌的有性孢子有( B )A.卵孢子B.孢囊孢子C.子囊孢子D.担孢子9.寄生真菌靠吸器吸收养料，吸器存在于（ D ）A.寄主体外表上B.寄主细胞外表上C.寄主细胞间隙中D.寄主细胞里面10.某些酵母菌上下两细胞连接处呈藕节状，通常称为（ B ）A.有隔菌丝B.无隔菌丝C.假菌丝11.大多数蕈菌属于（ D ）.A.接合菌类B.藻状菌类C.子囊菌类D.担子菌类二、填空题1.真菌的有性生殖过程可分为、、三个阶段.三、判断题1.八孢裂殖酵母菌的生活史属双倍体型.( - )2.担孢子是担子菌亚门的无性孢子.( - )3.子囊果根据有无开口及开口的大小分为子囊盘,子囊壳和闭囊壳.( + )4.菌核和子实体都是由菌丝形成的.( + )5.在担子菌的有性生殖过程中，核配发生在锁状联合形成后的次生菌丝顶端.( + )6.真菌的每一段菌丝都可以发展成为一个新的菌体.( + )四、简答题1.列出原核细胞和真核细胞的三项主要区别2.真菌的菌丝可以分化成哪些特殊的形态结构(至少答出五种)?它们的功能是什么?3.真菌能形成哪些有性和无性孢子?第三章一、名词解释病毒裂解量、效价、病毒、类病毒、烈性噬菌体、溶源性（溶源现象）二、选择题1.病毒显著区别于其他微生物的特征是( )A.具有感染性B.独特的繁殖方式C.体积微小D.细胞内寄生2.病毒的大小以（ B ）为单位度量A.μmB.nmC.mm3.E. coliT4曦菌体的典型外形是:（ B ）A.球形B.蝌蚪形C.杆状D.丝状4.病毒壳体的组成成份是:（ B ）A.核酸B.蛋白质C.多糖D.脂类5.类病毒是一类仅含有侵染性( B )的病毒.A.蛋白质B.RNAC.DNAD.DNA 和 RNA.6.可直接作为mRNA翻译蛋白质的病毒核酸类型是（ D ）A.双股DNAB.双股RNAC.负单股RNAD.正单股RNAE.单股DNA三、填空题1.烈件噬菌体入侵寄主的过程可分为、、、、等五个阶段2.病毒一步生长曲线有三个最重要的特征参效，即_期（包括_期和_期）和期的长短以及的大小.3.病毒的一步生长曲线反应三个特征参致、和.4.温和噬菌体能以整合在寄主细胞的染色体上，形成细胞，该细饱具有、、等几个特征(三个即可)5.温和噬菌体存在左式包括:、和6.溶源转变是指前噬菌体引起的溶源菌除免疫性外的其他表型改变，包括改变和转变.7.溶源菌对有特异性免疫力.8.朊病毒又称或，是一类能侵染动物并庄宿主细胞内复制的小分子无免疫性的疏水蛋白质.四、判断题1.一种细菌只能被一种噬菌体感染（ - ）2.病毒只含有一种核酸，DMA或是RNA（ + ）3.溶源性细菌在一定条件诱发下.可变为烈性噬菌性裂解寄主细胞.（ + ）4.原噬菌体即插入寄主染色体DNA上的噬菌体DNA.( + )五、简答题1.简述病毒的特点？ P672.试以花叶病毒为代表，图示并简述螺旋对称型杆状病毒的典型构造.P693.病毒的核酸有哪些类型？是举例并列表比较之.P714.病毒一步生长曲线可以分几期，各期有何特点？5.试述烈性噬菌体的侵染循环.第四章一、名词解释生长因子、化能自养微生物、主动运输、营养缺陷型、完全培养基、选择培养基二、选择题1.下列物质可用作生长因子的是( D )A.葡萄糖B.纤维素C.NaClD.叶酸2.能用分子氮作氮源的微生物有（ B ）A.酵母菌B.蓝细菌C.苏云金杆菌3.自养型微生物和异养型微生物的主要差别是( B )A.所需能源物质不同B.所需碳源不同C.所需氮源不同D.所需水分含量不同4.蓝细菌的营养类型属于( A )A.光能自养B.光能异养C.化能自养D.化能异养5.硝化细菌属于（ C ）型微生物.A.光能无机自养B.光能有机异养C.化能无机自养D.化能有机异养6.大肠杆菌属于（ D ）型微生物.A.光能无机自养B.光能有机异养C.化能无机自养D.化能有机异养7.单纯扩胜和促进扩散的主要区别是( C )A.物质运输的浓度梯度不同B.前者不需要能量，后者需要能量C.前者不需要载体，后者需要载体8.基团转位和主动运输的主要差别是（ C ）A.运输中需要各种载体参与B.需要消耗能量C.改变了被运输物质的化学结构9.水分子可通过（ B ）进入细胞.A.主动运输B.单纯扩散C.促进扩散D.基团转位10.用来分离固氮菌的培养基中缺乏氮源，这种培养基是一种（ C ）.A.基础培养基B.加富培养基C.选择培养基D.鉴别培养基11.用来分离产胞外蛋白酶菌株的酪素培养基是一种( D ).A.基础培养基B.加富培养基C.选择培养荃D.鉴别培养基三、填空题1.微生物生长繁殖所需六大营养要素是、、、、、.2.光能自养菌以作能源.以作碳源.3.光能异养菌以作能源，以为碳源.以作供H体.4.化能自养菌以取得能量，以作碳源合成细胞有机物.5.化能异养菌以作能源，以为碳源.以作供H体.6.按培养基外砚的物理状态可将培养基分为，，.四、判断题1.培养营养缺陷型微生物的培养基必须同时加入维生素、氨基酸，嘌呤及嘧啶（ - ）2.基础培养基可用来培养所有类型的微生物.( - )3.碳源对配制任何微生物的培养基都是必不可少的.( - )4.为使微生物生长旺盛，培养基中营养物质的浓度越高越好.( - )5.对含葡萄糖的培养基进行高压蒸汽灭菌时可以121. 3℃加热20 min即可.（ - ）6.伊红美蓝(EMB)培养基中，伊红美蓝的作用是促进大肠杆菌的生长.（ - ）五、简答题1.微生物的营养类型有哪几种?2.试比较营养物质进入微生物细胞的几种方式的基本特点.3.半固体培养基常用来观察微生物的运动特征.()4.有一培养基如下：甘露醇,MgSO4,K2HPO4,H2PO4,CuSO4,NaCl,CaCO3,蒸馏水.试述该培养基的 A.碳素来源；B.氮素来源；C.矿质来源，该培养基可用于培养哪类微生物？第五章一、名词解释呼吸、生物氧化、次级代谢二、填空题1.发酵是在条件下发生的.三、简答题1.在产能代谢中微生物可通过哪几种方式形成ATP?2.酵母菌可用作工业上生产甘油的菌株吗?为什么?3.试述生物氧化的形式、过程、功能及类型.4.比较呼吸作用与发酵作用的主要区别.5.化能自养微生物是如何被发现的?试从代谢角度分析化能营养菌对人类生活的影晌.6.何为初级代谢、次级代谢?二者间有何关系?7.自然界中铁有几种存在形式?徽生物怎样参与它们之间的变化?8.为何为硝化作用和反硝化作用?它们有何生态学意义?9.试述生物氧化的形式、过程、功能及类型.10.比较呼吸作用与发酵作用的主要区别.第六章一、名词解释生长曲线、微生物连续培养、抗生素、抗代谢物、灭菌、消毒、微生物的抗药性二、选择题1.如果将处干对数期的细菌移至相同组分的新鲜培养基中，该批培养物将处于哪个生长期?( )A.死亡期B.稳定期C.延迟期D.对数期2.杀死所有微生物的方法称为()A.消毒B.灭菌C.防腐3.常用的高压灭菌的泥度是()A.121℃B.200℃C.63℃D.100℃4.巴斯德消毒法可用于()的消毒.A.碑酒B.葡萄酒C.牛奶D.以上所有三、填空题1.细菌的典型生长曲线可分为、、、等四个时期.2.计算世代时间应在细菌生长的期进行3.连续培养的方法主要有和两种.4.如培养细菌的目的在于获得大量菌体，应在培养的期进行收获.5.抗代谢药物中的磺胺类是由于与相似，从而竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，使其不能合成.四、简答题1.测定微生物的生长有哪些方法?各有何优缺点?2.细菌的纯培养生长曲线分为几个时期，每个时期各有什么特点?3.试述影晌廷迟期长短的因素.4.与分批发醉相比.连续培养有何优点?5.试述微生物产生抗药性的原因.6.控刹微生物生长繁殖的主要方法及原理有哪些?第七章一、名词解释Ames test cryptic plasmid 温度敏感性突变株结合转导普遍性转导局限性转导流产转导转化感受态 F+菌株 F-菌株 Hfr菌株 F’菌株准性生殖基因工程菌种的退化菌种的复壮二、选择题1.一个大肠杆菌(E.coli)的突变株，不同于野生型菌株，它不能合成精氨酸这一突变株称为（）A.营养缺陷型B.温度依赖型C.原养型D.抗性突变型2.抗药性质粒（R因子）在医学上很重要是因为它们（）A.可引起某些细菌性疾病B.携带对某些抗生素的特定抗性基因C.将非致病细菌转变为致病菌D.可以将真核细胞转变为癌细胞3.在Hfr菌株中（）A.F因子插入在染色体中B.在接合过程中.F因子首先转移C.在接合过程中.质粒自我复制D.由于转座子是在DNA分子间跳跃的，因此发生高频重组4.当F+、F-杂交时（）A.F因子几乎总不转移到F+细胞中B. F-菌株几乎总是成为F+C.甚因重组的发生频率较高.D.F因子经常插入到F-细胞染色体上5.细茵以转化方式进行基因转移时有以下特性（）A.大量供体细胞的基因被转移B.包含有F质粒参加C.依靠噬菌体感染受体细咆D.可通过从供体细胞中提取DNA片段来完成6.准性生殖（）A.通过减数分裂导致基因重组B.有可独立生活的异核体阶段C.可导致高频率的基因重组D.常见于子囊菌和担子菌中7.不需要细胞与细胞之间接触的基因重组类型有（）A.接合和转化B.转导和转化C.接合和转导D.接合8.转导噬菌体（）A.仅含有噬菌体DNAB.可含有噬菌体和细菌DNAC.对DNA酶是敏感的D.含1至多个转座子三、填空题1.DNA分子中一种嘧啶被另一种嘌呤取代称为.2.Lederberg的影印培养实验证明了.四、判断题1.组氨酸突变株（his-）表示该菌不能利用组氨酸生长.（）2.色氨酸突变株（trp-）表示该菌本身不能合成色氨酸，因此不能再基本培养基上生长.（）3.普遍性转导产生的转导子一般都是非溶源菌.（）4.F+细菌或F'细菌与F-细菌接合时，是F-或F’细菌变成F+细菌.（）五、简答题1.用什么方法获得大肠杆菌（E.coli）的组氨酸缺陷型？2.什么叫转导？试比较普遍性转导与局限性转导的异同.3.比较转化与转导的区别.4.什么是F质粒？解释F质粒与接合的关系.5.试比较E.coli的F+、F-、Hfr、 F’菌株四个菌株的特点，并图示它们间的相互关系.6.什么是基因重组？在原核微生物中哪些方式可引起基因重组？7.自然遗传转化与人工转化之间有什么关系？为什么在一般情况下它们转化质粒的成功率有如此大的差别？8.给你下列菌株：菌株A F+，基因型A+B+C+、菌株B F-，基因型A-B-C-,问题：（1）支出A与B接合后导致重组的可能基因型；（2）当F+成为Hfr菌株后，A与B接合后导致重组的可能基因型.9.简述真菌的准性生殖过程，并说明其意义.10.什么叫基因工程?试图示并简述其基本操作过程.11.菌种衰退的原因是什么?12.如何对衰退的菌种进行复壮?第八章一、名词解释生态系统、择生生物二、填空题1.微生物与生物环境间有、、、、等关系.三、判断题2.民间制作的泡菜是利用乳酸菌产生的乳酸对其他腐败菌产生的拮抗作用才保证泡菜的风味、质量和良好的保藏性能.()四、简答题1.试用3个典型例子说明微生物与生物环境之间的有利关系.2.试论微生物在生态系统中的地位.3.试分析各种常见环境(空气、水体、土壤、农副产品及食品)中微生物分布的基本特点及与人类生活之间的关系.。

《环境生物学》第七章

把活性污泥微生物对有机废水有机物或基质的生化呼吸线与其内源呼吸线相比较，作为基质可生物降解性的评价指标，可作出如图7-1所示的耗氧曲线，有三种情况：
结论：（1）生化呼吸线位于内源呼吸线之上，表明该有机物或废水可被微生物氧化分解。两条呼吸线之间的距离越大，有机物或废水的生物降解性越好；反之亦然（图7-1A）。（2）生化呼吸线与内源呼吸线基本重合，表明该有机物不能被活性污泥微生物氧化分解，但对微生物的生命活动无抑制作用（图7-1B）。（3）生化呼吸线位于内源呼吸线之下，说明该有机物不能被微生物分解，且对微生物生长产生了有害抑制作用，生化呼吸线越接近横坐标，抑制作用越大（图7-1C）。 3、测定相对耗氧速率曲线
第七章生物净化和治理的传统方法
[本章要点]
本章介绍了环境生物技术的定义、研究内容和在环境领域中的应用，阐述了微生物处理污染物的特点、原理、影响因素和传统微生物处理法的工作原理和方法。
环境生物技术（environmental biotechnology）诞生的背景：
由于人们的生产，生活活动对环境造成了各种各样的污染，人类的生存和发展面临着严峻的挑战，迫使人类必须发动一场“环境革命” 来拯救自身，环境生物技术因此而诞生并日益受到重视，人们把生物技术开发和应用的注意力转向环境保护。
6.废物强化处理技术研究
7.环境的生物监控技术研究
四个热门方向：
基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，如何解决其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面问题
开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物农药、生物肥料以及利用废物生产生物能源，例如甲烷、氢气、乙醇等
耗氧速率就是单位生物量在单位时间内的耗氧量，生物量可用活性污

第七章基因工程菌的发酵生产

生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体（2）选择适宜的培养方式（3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件（4）固定化技术
生物工艺学第二节基因工程菌的培养工艺培养基的组成与培养条件碳源氮源无机盐生长因子营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分接种量
生物工艺学
院系：生物医药系教研室：生物工程
北京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制溶解氧对发酵的影响及其控制菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商泡沫对发酵的影响及其控制发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范（1）接种（2）机械密封（3）取样（4）排气（5）排液基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义基因工程菌特点基因工程菌质粒的不稳定影响质粒稳定性的因素提高质粒稳定性的措施基因工程菌培养基的组成与培养条件基因工程菌发酵的工艺过程质粒稳定性的分析实现高密度发酵的方法基因工程菌发酵过程的检测与控制基因重组菌外漏的防范基因工程产物的提取

第七章_基因工程菌苗2013

2.灭活死菌疫苗
通过加热处理或福尔马林、戊二醛、β-内
酯等化学处理得到如霍乱死菌苗，百日咳死菌苗等。死菌苗的
主要优点是稳定，缺点是需要多次免疫才能
得到好的保护效果。
灭活死菌苗须加佐剂以提高免疫效果。
3.亚单位或成分苗
①从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的类毒素苗，如破伤风类毒素（ TT ）、白喉类毒素（ DT ），免疫后诱导机体产生的抗血清能特异中和 TT 破伤风类毒素或 DT 白喉类毒素，其保护效果可达95%以上。由于毒素纯化方法的改进，
—
s.c
菌苗 5 6 百日咳菌苗脑膜炎球菌苗（A、C 群）脑膜炎球菌苗（A/C/Y/W-35群）流脑A群多糖-破伤风蛋白结合菌苗伤寒菌苗（Ty21a）伤寒菌苗（Ty21a）伤寒Vi多糖苗精制破伤风菌苗精制白喉菌苗
类型类毒素灭活菌苗多糖成分
预防的疾病百日咳炭疽脑膜炎
8.
易于生产，储存及服务，不需冷藏。
第三节重要细菌基因工程苗的研究进展P193
现有传统菌苗对重要细菌感染性疾病存在的问题： ①现有菌苗保护效果不好； ②副反应大； ③难以培养的细菌； ④可诱发癌变，有严重后遗症； ⑤新出现的病原体或新变异病原菌。
一、霍乱菌苗 P193
霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病。临床表现轻重不一，轻者仅有轻度腹泻；重者剧烈吐泻大量米泔水样排泄物，并引起严重脱水、肌肉痉挛，酸硷失衡、周围循环衰竭及急性肾功能衰竭。
类型
类毒素
预防的疾病
白喉，百日咳
国内
i.m
国外
12 13 14 15
灭活全苗
类毒素灭活全苗类毒素外膜成苗
破伤风

生物制品学(Biologics)

1)干扰素（Interferon）； 2)集落刺激因子（CSF, Colony Stimulating Factor）； 3)白细胞介素（interleukin, IL）； 4)肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）； 5)趋化因子（Chemokine）； 6)转化生长因子β（Transforming Growth Factorβ,TGFβ）； 7)生长因子（Growth Factor, GF）。
生物化学
学
(Biochemistry)
(Molecular
遗传学
Biology)
(Genetics) 细胞生物学
分子细胞学
现
(Cytobiology)
(Molecular cytology)
代
化学工程
(Chemical
生化工程学
生
Engineering)
(Biochemical
生命科学 (Life science)
1、按来源分（according to the source )
➢ ① 人源生物制品（如各种血液成分等），（Human source） ➢②动物源生物制品（干扰素、激素、蛇毒等）；
（Animal source） ➢ ③植物源生物制品（植物激素、Taxol、长春碱、喜树碱）；
（(Plants source） ➢ ④微生物源生物制品（生长激素、干扰素、胰岛素等）。
2、治疗
➢① 免疫血清
采用特异性免疫血清治疗相应感染或传染病，一般称其为特异血液疗法。
生物制品中的免疫血清多指抗毒素、抗菌血清和抗病毒血清。
➢②疫苗
目前，应用于治疗的疫苗不多。布氏杆菌疫苗用于治疗布氏杆菌病；卡介苗和厌氧性棒状杆菌疫苗常用作免疫佐剂治疗某些疾病；生态疫苗，如促菌生类，用于调整机体肠道的正常菌群起到防止肠道疾病的作用。

基因工程菌-简单的案列

116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4
The characteristics of azoreductase from Shewanella oneidensis MR-1
Shewanella oneidensis MR-1
E.Coli K12 I-TASSER Software
EcoRI 剪切目的基因
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGCATCTTAA GGGATT
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA GGGATT
AATTCCGTAG 目的基因 GGCATCTTAA
黏性末端
基因操作( 基因操作(gene engineering)的工具
基因工程(gene engineering) 基因工程
原
理：
基因重组
操作水平： DNA分子水平操作水平： DNA分子水平结果：定向地改造生物的遗传性状，定向地改造生物的遗传性状，
获得人类所需要的品种。获得人类所需要的品种。
培育转基因大肠杆菌的简要过程：培育转基因大肠杆菌的简要过程：
（1）作用对象：两个具有相同粘性末端的DNA片段。作用对象：两个具有相同粘性末端的DNA片段。 DNA片段（2）作用位置：脱氧核糖与磷酸之间的缺口（磷酸作用位置：脱氧核糖与磷酸之间的缺口（二酯键）。二酯键）。（3）作用结果：形成重组DNA。作用结果：形成重组DNA。 DNA
G AA T T C C T T AA G 用同种限制酶切割 G AA T T C G
1 2
基因工程的操作工具 1.基因的剪刀基因的剪刀 ——限制性内切酶限制性内切酶 2.基因的针线基因的针线 ——ＤＮＡ连接酶ＤＮＡ连接酶ＤＮＡ 3.基因的运输工具基因的运输工具 —的 1.目的基因的提取目的基因的提取 2.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合目的基因与运载体 3.目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞目的基因导入 4.目的基因的检测与表达目的基因的检测目的基因的检测与

基因工程疫苗

3、核酸疫苗（nucleic acid vaccine）
核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗 (genetic vaccine),是指将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。
5 、蛋白工程疫苗（ protein engineering vaccine ）蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。
（二）遗传重组疫苗（genetic recombinant vaccine）
多需与一个载体骨架分子相耦联。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒（ FMDV ）合成肽疫苗，主要集中在 FMDV 的单独 B 细胞抗原表位（ VPI 环）或与T 细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究。虽然取得了一定的进展，但仍未获得一种具有理想保护作用的合成肽疫苗
（四）抗独特型抗体疫苗（antiidiotype vaccine）
vaccine）
合成肽疫苗是一种仅含免疫决定簇组分的小肽 , 即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽, 与载
体连接后加佐剂所制成的疫苗 ,是最为理想的安全新型疫
苗,也是目前研制预防和控制感染性疾病和恶性肿瘤的新型疫苗的主要方向之一
合成肽疫苗分子是由多个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位共同组成的，大
抗独特型抗体疫苗是指使用与特定抗原的免疫原性相近的抗体（ab2）做抗原制成的疫苗。
目前此疫苗尚处于理论性研究阶段。

基因工程工程菌构建

实例二：某工程菌的应用效果
应用领域
01
用于生产某种药物或工业酶。
应用效果
02
通过工程菌的构建和优化，实现了目标产物的高效表达和纯化
，降低了生产成本，提高了产品质量和产量。
经济效益
03
工程菌的应用为企业带来了显著的经济效益，推动了相关产业
的发展。
实例三：某工程菌的改进与优化
改进目标
提高工程菌的生长速度、产物表达量或产物纯度等。
基因工程工程菌构建
汇报人：XX
目录
• 引言 • 基因工程原理与技术 • 工程菌构建流程 • 工程菌构建实例分析 • 工程菌构建的挑战与解决方案 • 工程菌在生物医药领域的应用前景
01
引言
基因工程概述
基因工程定义
基因工程是通过对生物体基因进行改造和重组，以实现特定目标的方法和技术。
常用技术
包括基因克隆、基因编辑、基因转移等。
抗体药物研发
通过基因工程技术改造工程菌，实现抗体药物的高效表达和纯化。
疫苗研发与生产
利用工程菌生产疫苗，如基因工程疫苗、重组亚单位疫苗等，提高疫苗的安全性和有效性。
基因治疗与细胞治疗
基因治疗载体
工程菌可作为基因治疗的载体，将治疗基因导入患者体内，修复或替换缺陷基因。
细胞治疗辅助工具
利用工程菌生产细胞治疗所需的生长因子、细胞因子等，促进细胞生长和分化。
通过代谢工程手段，改造工程菌的代谢途径，提高其对底物的利用效率和产物合成能力。
提高遗传稳定性
采用合适的基因整合方法，确保外源基因在工程菌中的稳定遗传和表达。
03
工程菌构建流程
目标基因的选择与获取
选择目标基因

基因工程菌培养培训课件

1/14/2021
基因工程菌培养
15
3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。
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基因工程菌培养
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1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出
现分离丢失。
为什么会出现质粒丢失呢？
质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细ห้องสมุดไป่ตู้）和
低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷
贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代
细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少
遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
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基因工程菌培养
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三、利用基因工程菌生产的特点
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。
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基因工程菌培养
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3、低等真核细胞
酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物
现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等

基因工程菌苗2013

细菌一旦获得耐药性，存在与细菌染色
体、质粒和转座子中的耐药基因就可通过转化、转导、接合和转座等方式，将抗性基因传播到其他敏感菌，使之成为抗药菌株，给临床传染病的治疗带来困难。据 WHO1996年报告，全球每年死亡约 5190万人，其中1/3约1730万死于传染病。
新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继开始。
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatio）粪肠球菌（Enterococcus faecalis, E.faecium）
鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）
E.coli K12 肺炎球菌
军团菌（Legionella
一、目前应用菌苗的类别按菌苗所含的成份，菌苗可分为3类，即减毒活菌疫苗、灭活死菌疫苗、纯化的多糖或蛋白成份疫苗。
1、减毒活菌疫苗
如卡介苗（BCG），是巴斯德研究院A. Calmette和Guerin,C等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘油-胆汁-马铃薯培养基上传230代后（13年），获得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即BCG。对免疫婴幼儿有保护效果。后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行比较，方知BCG缺失了毒力相关基因。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。
，产品的副作用很小；
②荚膜细菌纯化的多糖菌苗，可诱导产生的抗体能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流感杆菌 b(Hib) 、伤寒杆菌 Vi 多糖等多糖苗
，能诱导机体产生T细胞非依赖的抗体反应，其
特点是诱导产生短期的 IgM 抗体，缺乏免疫记

基因工程菌培养(整理)

精心整理
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大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白到达高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
有的蛋白转译后还要进展修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。
附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和平安，降低本钱并不重要。
精心整理
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二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求平安，列入 FDA表中常用的宿主系统有：大肠杆菌
精心整理
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4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么变异了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。
〔四〕表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖构造类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
精心整理
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三、利用基因工程菌生产的特点
〔一〕基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丧失外源基因的菌往往比未丧失质粒的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丧失的菌的生长，一般在培养中参加选择压力，如抗生素。
〔二〕基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，参加诱导因子，诱发产物表达。

微生物基因工程菌PPT课件

染刺吸式口器的昆虫和处于非取食期的昆虫卵和蛹等真菌侵染和致病机制复杂，害虫难以对真菌制剂产生抗性对病虫害的持续控制作用, 可以形成昆虫间的流行病对哺乳动物毒性低, 对环境的影响小
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目的基因的构建
1. 利用病原真菌的毒力基因，例：真菌孢子附着基因，穿透体壁基因等
2. 利用外源毒力基因，例：蝎毒素基因、苏云金芽胞杆菌毒素基因等
3. 利用人工设计并合成基因
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
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谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
优势 ➢ 基因克隆表达系统完善
➢ 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
➢ 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
➢ 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
4
工程菌高密度发酵工艺
自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌 (RRhPI-pQE40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体在进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞密度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅度更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外源基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往还需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成。需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜的消泡剂。