第七章植物基因工程1-4

第八章植物基因工程

基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。

植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。

植物转基因研究的用途：

1）理论研究：如基因功能分析；

2）实践应用：如作物遗传改良。

基因工程的基本内容

1）目的基因的分离；

2）目的基因与载体连接；

3）重组分子转入寄主细胞并繁殖；

4）阳性克隆的筛选；

5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因；

6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。

植物基因工程的一般流程

目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测→转基因植物的表型鉴定→转基因植物的遗传分析、田间试验

经遗传改良的生物, 统称：

genetically modified organism (GMO)；

Genetically engineered organism (GEO)。

转基因植物(transgenic plants), 又称：

genetically modified plant (GMP)；

genetically modified crop (GMC)。

第一节目的基因的分离

目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段，称为~。

可能是:

1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区；

2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）；

3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。来自DNA分子中的外显子。

4）一个完整的操纵子或基因簇；

5）只含启动子或终止子等元件的DNA 片段。

1. 分离目的基因的策略/方法：

1) 基于已知/同源序列--分子杂交/筛库与PCR；

cDNA文库和基因组文库

（1）构建基因组文库或cDNA文库；

基因组文库：将生物基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体连接并导入宿主细

胞，进行扩增。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，包含该生物所有的基因。

cDNA文库(cDNA library)：以某一组织、器官或处理材料中的mRNA为模板，逆转录成双链cDNA 分子，插入载体形成重组分子，再导入宿主细胞进行扩增。这些在重组体内的cDNA 的集合，即为cDNA文库，包含正在表达的基因。

（2）用已知或同源序列标记探针、筛库。

经典、较常用。

筛库--菌落原位杂交

如果所要获得的基因在其它植物上已经分离,序列已知,则可以采取以下两种方法分离研究植物上的相关基因:

一是基因序列同源克隆法。根据发表的序列设计引物,以基因组DNA 或mRNA 反转录的cDNA 为模板进行PCR 扩增。如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库获得全长基因或用RACE得到全长基因。

二是用作探针直接筛库。若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA 文库和基因组(gDNA)文库,获得研究植物里的基因.

（3）用PCR技术扩增目的基因

gDNA-PCR;

RT-PCR

RACE-PCR；

简捷、常用

2) 基于转录本表达差异

DDRT-PCR：mRNA差异显示技术，

DDRT-PCR: 根据真核生物3′端poly(A)尾的特点设计锚定引物, 这些引物组合扩增后约能得到大致包括某一发育阶段的全部基因,扩增后利用测序胶分离,放射自显影或银染获得结果,并对差异片段回收、克隆、测序以确定其是否为目的基因。

SSH：抑制性差减杂交，此技术是以抑制PCR和杂交二级动力学为基础的DNA扣除杂交方法。含有目的基因的样品称为检测方,不含有目的基因的样品称为驱动方。

3) 基于人工突变体-T-DNA标签法与转座子标签法；适用于模式植物

T-DNA: 根癌农杆菌Ti质粒中一段可转移DNA，插入基因引起突变。

机制：

T-DNA 或转座子随机插入到基因组的某一位点,引起该位点基因功能改变,这个位点就被标记,再利用T-DNA 或转座子序列探针对突变基因组文库进行筛选或设计引物扩增,就可以分离出标记位点的基因。

4) 基于分子标记连锁图谱-图位/定位克隆；--要求精细物理图谱等

图位克隆：从一种基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因，又叫定位克隆。

机制：

根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座位,利用分子标记对目的基因进行精细定位,并用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA 文库(包括Y AC、BAC、TAC、PAC 或Cosmid库) ,从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步查(chromos ome walking )逐步逼近目的基因或通过染色体着陆(chromos ome landing)的方法最

终找到含有目的基因的克隆,再经过遗传转化证实目的基因的功能.

图位克隆的技术环节

（1）构建遗传作图群体用于作图群体的类型可有多种。

（2）筛选与目标基因连锁的分子标记。

（3）局部区域的精细定位、作图

（4）构建高质量的基因组文库

（5）染色体步行、登陆。

（6）鉴定目标基因

图位克隆的基本流程：

（1）构建遗传图谱：目的基因初步定位→分子标记；

（2）构建物理图谱：局部区域的精细作图，目的基因精细定位(kb/cM)；

（3）构建基因组文库：BAC、YAC、Cosmid等；

（4）染色体步行或登陆：获得候选克隆→探针；

（5）筛选基因文库：获得目的克隆；

（6）鉴定目的基因。

5) 其他方法-

人工合成，适用于小基因、突变或修饰；

基因表达谱(Macroarray/Microarray)分析:基因芯片/微矩阵

第二节基因克隆的主要工具酶

1. 限制性核酸内切酶

限制作用:指宿主细胞利用限制酶降解外源DNA，保护其遗传稳定的现象。

修饰作用: 指宿主细胞通过甲基化酶使自身DNA进行甲基化修饰, 达到识别自身和外来DNA 、使自身DNA免遭限制酶降解的现象

两种末端--

粘性末端：酶切位点在两条DNA单链上反向互补，产生的两个末端碱基互补配对，易连接。平齐末端：酶切位点在两条DNA单链上相同，形成平齐末端，较难连接。

限制酶：一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割双链DNA分子的核酸水解酶，水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。2. DNA连接酶

DNA连接酶：催化双链DNA切口（nick, 而非裂口/缺口gap) 处的5`-P和3`-OH生成磷酸二酯键，需能量。

T4 DNA连接酶: 需ATP，制备容易，连接具有粘性末端或平末端的DNA分子，应用广泛。

3. DNA聚合酶

1) E.coli DNApol I：制备探针、缺口填充等。

2) Klenow片段(E.coli DNApol I 经蛋白酶处理, 获得N端三分之二的大肽段) : 补平粘端、DNA 片段末端标记、cDNA第二链的合成等。

3) 逆转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，合成cDNA链。AMV和MLV。

4) 耐热DNA 聚合酶：Taq DNA 酶、Pfu DNA 聚合酶等。

第三节受体细胞/系统

定义：外源DNA导入、扩增、表达的细胞。

对受体菌的要求:

１）易于转化或转导：感受态；

２）限制-修饰系统缺陷型；