植物基因工程实验技术指南(王关林,方宏筠)思维导图
花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展
花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展果树的基因转化研究早在1988年，首先在核桃上取得突破，McGranahan等获得了转gus基因核桃再生植株。
此后，果树转基因工程研究日益发展，许多果树获得了转基因植株，但是与农作物的转基因工程研究相比，果树转基因工程还是远远处于落后状态。
最难转化的禾谷类，现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段，而果树仅有一例转基因植物进入田间试验（方宏筠等，1999）。
我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作，并都获得了转化目的基因的转基因植株，特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验，该项研究处于国际领先水平。
1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。
相对于农作物而言，果树转基因技术及研发相对滞后转化体系仍有待进一步完善，但果树基因工程也有其突出的优势。
目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。
在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。
侯立群（2000）等利用花粉管通道发进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。
山东农业大学张玲（2004）利用花粉管通道法对杏转化抗寒基因相关研究。
由于果树，栽培环境复杂、生产周期长，且主要为风媒传粉植物，与作物相比，在影响树种自身遗传多样性等方面，其潜在的生态风险性可能更大。
随着果树转基因成功事例逐年增加，转基因果树的生态安全性问题也越发受到重视。
由于花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。
三系法与二系法杂交育种方法的比较
第23卷第5期 唐山师范学院学报 2001年9月 Vol. 23 No.5 Journal of Tangshan Teachers College Sep. 2001────────── 收稿日期：2001-07-18作者简介：陈玉芹（1953-），女，河北迁安人，唐山师范学院生物科学技术系副教授。
- 12 -三系法与二系法杂交育种方法的比较陈玉芹(唐山师范学院 生物科学技术系，河北 唐山 063000)摘 要：对三系法和二系法杂交育种进行了比较，结果表明，三系法是一种行之有效的传统育种方法，但它必须要三系（不育系，保持系，恢复系）配套，增加了育种的时间和资金；而二系法选用光敏核不育系的自交不育系做母本，用加显性标记基因的恢复系作父本，省去了繁殖保持系的工作，同时，这种不育系会因光照长度或温度高低（或两者兼有）而在可育与不育之间互相转换，而这些条件都可以人为控制，这既保证了杂种优势的利用，又节省了资金，是一种具有广阔前景的育种方法。
关键词：三系法；二系法；杂交育种；光敏核不育系中图分类号：Q32 文献标识码：A 文章编号：1009-9115（2001）05-0012-03由于人口增加，环境污染，土地贫瘠造成可耕地面积不断缩小，原材料逐渐减少，在农业上，大幅度提高粮食产量，保证充足的粮食供应，改善人们的物质营养，是21世纪人类需要解决的最重要的问题之一。
中国是一个人口大国，又是农业古国，现在她以仅占全球7%的耕地解决了占世界22%的人口吃、穿问题而瞩目于世界。
在这项工作中特别应该提到的是被称为“杂交水稻之父”的袁隆平教授，他是世界上第一个成功地利用水稻杂交优势的人。
他使过去亩产只有300多公斤的水稻产量增加到500多公斤。
而他现在正在培育的超级杂交水稻将把亩产进一步提高到800多公斤。
袁隆平教授利用三系法培育出高产、优质的水稻品种，使得杂种优势得以充分发挥出来。
现在他研究的超级水稻将采用二系法配制优良种子，充分发挥杂种优势作用。
基因工程思维导图(1)
是编码产生蛋白质或RNA 等具有特定功能产物的DNA 片段，是控制生物性状的基本遗孟德尔——遗传因子Yohannsen ——基因摩尔根——基因位于染色体上 遗传物质的基础是核酸（DNA ） 三联子密码转录与翻译控制生物形状是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的简称获得目的基因基因与克隆载体连接，形成重组子 基本步骤 重组子转化受体细胞，获得转化子转化子检测和筛选目的基因在受体中被表达，获得所需的遗传性状或产物 基因操作的剪刀：限制性内切酶 基因操作的针线：连接酶 基因操作的载体：质粒与病毒基因操作的车间：细菌(大肠杆菌）、真菌（酵母）和病毒基因具有相同的物质基础基因是可切割和可粘合的基因是可转移的 多肽与基因之间有对应关系 遗传密码通用基因可以复制遗传基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确应用目的的活动。
1973年（基因工程元年）生物感应器遗传改良基因治疗DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，限制性内切酶第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。
第二、三个字母：取宿主种名前两个字母，小写斜体第四个字母：为宿主的株号，正体第五个字母：发现顺序号，大写罗马字体，正体现象限制与修饰 1型种类 2型3型识别长度：4-8个碱基，最常见6个碱基限制酶识别序列识别序列结构:回文结构切割位置：在识别位置的内部或两侧平末端黏末端不同或相同末端的限制性内切酶。
即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。
限制酶产生的末端同序同切酶（完全同裂酶）同序异切酶（非完全同裂酶）同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。
同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
DNA末端长度对限制酶切的影响位点偏爱星星活性缓冲液酶切反应条件反应温度反应时间终止酶切方法：EDTA螯合镁离子，加热，苯酚抽提去除蛋白质或试剂盒纯化DNA影响限制酶活性因素：DNA样品浓度，甲基化程度，分子结构，缓冲液性质，酶切温度时间概念：催化3'羟基和5'磷酸基之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。
CMV启动子克隆及其在植物体内的表达
CMV启动子克隆及其在植物体内的表达于秀敏;岳文冉;王瑞刚【摘要】根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(034)002【总页数】6页(P187-192)【关键词】植物;CMV启动子;GUS;瞬时表达;增强型35S启动子【作者】于秀敏;岳文冉;王瑞刚【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】Q945.78植物基因工程已取得较大进展，但能用于植物基因工程的启动元件还非常有限.CaMV 35S启动子是目前植物基因工程中使用最为广泛的启动子［1－4］.然而，近年来有关启动子特别是35S启动子引发的转基因沉默的报道越来越多［1，5］.不仅如此，35S启动子的可调控性也不高，不利于外源基因表达的有效调控［6］.而且，它在单子叶植物中的表达强度也比较低［7－8］.因此，寻找新的启动子或改良现有启动子以便植物基因工程有更多的基因调控系统已成为当前植物基因工程研究的热点.细胞肥大病毒（cytomegalo virus）CMV启动子和35S启动子均为病毒来源的启动元件，基因结构较小，并具有较高的表达强度［9－10］.由此推测CMV启动子具有与35S启动子相似的表达特性，即可能具有在植物表达的特性.本文通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶组织内的瞬时表达，试图探讨该启动子在植物体内的表达特性和应用于植物基因工程的可能性.1.1 材料1.1.1 植物材料野生型烟草（Nicotianatabacum）品种：革新一号.本实验使用6～12周龄烟草的完全展开叶片.1.1.2 用于PCR克隆的引物与模板用于CMV启动子PCR克隆的引物为由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES，INC公司合成.模板为pcDNA3.1－Myc－His－A（5523bp）.1.1.3 菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α，农杆菌LBA4404（Rifr，Strr），中间载体PUC19／2×35S－GUS，pGPTV－Kan由本实验室提供.实验所用PCR Product Cleaning Up Kit，DNA Gel Extraction Kit以及Plasmid Miniprep Kit购自Qiaen A.Taq DNA Polymerase购自TaKaRa公司，限制性内切酶BglⅡ，HindⅢ，EcoRⅠ和T4DNA Polymerase购自Fermentas公司，其他化学试剂均为国产或进口分析纯.1.2 方法1.2.1 CMV启动子的克隆分别以1.1.2所述PCR引物及模板进行PCR扩增.PCR反应体系参见Taq DNA Polymerase说明书.PCR反应程序为94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火1min，68℃延伸3min，30个循环；68℃延伸7min.PCR产物经质量浓度为10g／L的琼脂糖凝胶电泳分离后，并经DNA Gel Extraction Kit纯化收集，4℃临时保存备用（或－20℃冻存）.1.2.2 CMV启动子与PUC19／2×35S－GUS重组载体的构建分别用BglⅡ和HindⅢ双酶切CMV启动子的PCR克隆产物和植物表达载体PUC19／2×35S－GUS，质量浓度为10g／L的琼脂糖凝胶电泳分离CMV启动子的PCR酶切产物的700（714）bp左右的片段以及载体PUC19／2×35S－GUS酶切产物中的大片段.用DNA Gel Extraction Kit回收目的基因片段和载体大片段，将2片段用T4DNA Polymerase进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将菌液涂于抗性筛选（Amp，100mg／L）的LB平板上，筛选重组表达载体PUC19／CMV－GUS intron.菌落PCR初步鉴定后，小量提取质粒进行BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定，得到正确的重组表达载体PUC19／CMV－GUS intron，标记为PCG.1.2.3 重组质粒PUC19／CMV－GUS intron与载体pGPTV－Kan的重组用HindⅢ和EcoRⅠ对PUC19／CMV－GUS intron质粒DNA和中间载体pGPTV－Kan质粒DNA进行双酶切，经10g／L的琼脂糖凝胶电泳分离PUC19／CMV－GUS intron的2.9kb和pGPTV－Kan的酶切大片段，并用DNA Gel Extraction Kit回收片段.将2片段用T4DNA Polymerase进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，双抗性（40mg／L Rif＋100mg／L Kan）LB平板筛选重组表达载体pGPTV－Kan／CMV－GUS intron，标记为LpPCG，挑取阳性克隆进行菌落PCR初步鉴定，小量提取质粒进行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定.同时将pGPTV－Kan质粒DNA转入大肠杆菌DH5α，获得pGPTV－Kan中间载体，标记为LpGPTV.1.2.4 农杆菌植物组织渗入与瞬时性表达用电转化法将以上2种重组质粒转化农杆菌LBA4404，挑取阳性克隆，进行PCR 鉴定.获得植物表达载体LpPCG和LpGPTV.选择完整的位于植株中部偏上的完全展开叶片，用1mL塑料注射器将农杆菌悬浮液从叶背注入细胞间隙，渗入组织位于叶主脉及2排次脉之间，面积约4cm2左右，渗入农杆菌悬浮液量为100μL.每个叶片以叶脉分隔，渗入8～16点，于室内22～25℃，16／8h光暗条件下培养48h.1.3 荧光法GUS活性检测将含有渗透位点的叶组织片收集到1.5mL的Eppendorf管中，加入500μL的GUS提取液，液氮冷冻后冰浴下研磨.4℃离心10min，取出50μL上清液加入250μL的GUS检测溶液和200μL GUS提取液.立刻从混合液中移出另一个50μL的等分试样，加入2mL的终止液用做对照.其余的混合物37℃保温60min.用50mmol／L，pH7.0的磷酸钠缓冲液冲洗3次，按荧光检测法检测GUS表达活性.1.4 数据处理采用EXCEL2003系统进行作图及统计分析.根据CMV启动子设计了其PCR克隆引物，高保真PCR克隆CMV启动子，利用其与中间载体PUC19／2×35S－GUS和pGPTV－Kan的重组中分别获得其与GUS intron和NPTⅡ基因的融合，从而得到具有Kan抗性的表达载体.2.1 CMV启动子的克隆PCR扩增CMV启动子，得到大小在0.7kb左右的PCR产物（图1），其长度与实验设计的CMV启动子的714bp的序列长度接近.推测该PCR产物是CMV启动子.2.2 重组质粒PUC19／M15K－GUS intron的构建及其鉴定利用CMV启动子PCR产物酶切片段，与中间载体PUC19／2×35S－GUS的重组，得到了PCG重组子，其PCR检测结果（图2）与上述结果一致.BamHⅠ＋HindⅢ双酶切和HindⅢ＋EcoRⅠ双酶切的检测结果（表1，图3）表明，重组表达载体PUC19／CMV－GUS intron构建正确.PCG的HindⅢ、EcoRⅠ双酶切片段CMV－GUS与pGPTV－Kan重组子pPCG 检测结果也得到与图3相似的CMV启动子扩增条带.其BamHⅠ＋EcoRⅠ双酶切和HindⅢ＋EcoRⅠ双酶切的检测结果（表2，图4）证实该重组子是正确的. 2.3 CMV启动子在植物体内的瞬时性表达利用荧光法检测了CMV和2×35S启动子指导的GUS基因在烟草叶组织中的瞬时表达活性.结果表明（图5），CMV和2×35S启动子均可指导GUS基因的瞬时性表达.同时发现，CMV启动子的表达活性达到2×35S启动子的（80.4±26.6）%（n＝6）.3.1 CMV启动子在植物体内的瞬时性表达瞬时表达系统是研究启动子功能及活性的重要手段之一.由于瞬时性表达的外源基因在受体植物细胞内是游离于染色体之外的，因此，其表达受受体植物基因组的影响相对较小，其启动子活性基本反映了启动子本身的表达特性［11－12］.同时，利用瞬时性表达系统可以定性和定量地研究启动子的表达活性.通过荧光检测法，CMV启动子可指导GUS基因的瞬时性表达.3.2 CMV启动子在植物基因工程中的潜在应用价值前人对35S启动子的研究结果表明，35S启动子存在2个重要区域，即从－90至＋8的A区和－343至－90的B区.其A区主要负责在胚根、胚乳及根组织中表达；而B区则主要控制胚、子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内的表达［2］.Benfey等利用UidA基因证实了35S的－90至－46区域和－343至－90区域分别是在根部和叶部表达所必需的［13］.有人将35S的－343至－90区域作顺向重复排列构成了增强型35S双启动子（2×35S），并证明其表达活性显著增强.另外，郝林等的研究证明2×35S启动子在拟南芥中的表达水平比35S启动子高出11倍［1］.笔者的上述实验结果表明，CMV启动子均具有相当于2×35S 启动子80%左右的活性，这说明，CMV启动子在植物体内具有较高的表达活性.这一结果表明，CMV启动子可能为植物基因工程中表达外源基因提供新的启动子选择，也就是说CMV启动子在植物基因工程中具有潜在的应用价值.由于CMV启动子是动物基因工程中的启动元件，因此，这一实验结果表明，某些动物来源的启动子也同时具有植物表达活性.也就是说动植物启动子在基因表达调控机制上存在着共同之处.早先把果蝇HSP70启动子具有植物表达活性作为例外［14］，从笔者的上述研究结果看，HSP70启动子的植物表达活性可能并非例外.实际上，已有结果表明，CaMV 35S启动子在非洲爪蟾（Xenopusoocytes）和HeLa细胞内的作用与CMV启动子一致，表现出较高的表达活性［15－16］.这些结果同时说明，过去认为动物启动子不被植物所识别的观点应当改变［2］.植物与动物同属于高等真核生物，在基因结构、组成及表达调控方面存在诸多相似之处，如基因的不连续性、高度重复性以及相似的加工、修饰机制.上述结果说明了动植物基因启动子的调控机制有其同源性，因此，在基因调控水平上研究和寻找动、植物基因的通用性，无论在基础理论上还是在应用上都具有重要意义.【相关文献】［1］郝林，曹军.CaMV 35S双启动子显著提高转基因在拟南芥中表达水平的研究［J］.植物生理学通讯，2000，36（6）：517－519.HAO Lin，CAO Jun.A double CaMV 35Spromoter efficiently enhances the level oftransgenic expression inArabidopsis［J］.Plant Physiology Communications，2000，36（6）：517－519.［2］王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术［M］.北京：科学出版社，1998.WANG Guanlin，FANG Hongjun.The principle and technology of plant gene engineering ［M］.Beijing：Science Press，1998.［3］李杰，张福城，王文泉，等.高等植物启动子的研究进展［J］.生物技术通讯，2006，17（4）：658－661.LI Jie，ZHANG Fucheng，WANG Wenquan，et al.Advance in the study of higher plant promoter［J］.Letters in Biotechnology，2006，17（4）：658－661.［4］ ALKAFF N S，KREIKE M M，COVERY S N.Plants rendered herbicide－susceptible by cauliflower mosaic virus－elicited suppression of a 35Spromoter－regulated transgene ［J］.Nat Biotechnol，2000，18（9）：995－999.［5］ HOLTORF S，APEL K，BOHLMANN parison of different constitutive and inducible promoters for the transgenes inArabidopsisthaliana［J］.Plant Mol Bio，1995，29（4）：637－646.［6］徐子勤.重要禾谷类植物转基因研究［J］.生物工程进展，2001，21（1）：59－74.XU Ziqin.Transgenic researches of important cereal species［J］.Progress in Biotechnology，2001，21（1）：59－74.［7］ BRUCE W B，CHERISTENSEN A H，KLEIN T.Photoregulation of a 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药用植物毛状根的诱导及其应用
药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。
文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。
早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。
直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。
T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。
Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。
因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。
f.改进的CTAB法提取盐生植物基因组DNA
第19卷 第2期2007年6月 塔 里 木 大 学 学 报Journal of Tari m UniversityVol.19No.2Jun.2007① 文章编号:1009-0568(2007)02-0060-03改进的CT AB法提取盐生植物基因组DNA王彦芹 罗晓霞 刘陈 李霞 陈良 杨剑(新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔 843300)(塔里木大学植物科技学院,新疆阿拉尔 843300)摘要 用改进的CT AB法提取猪毛菜、碱蓬、骆驼蓬、骆驼蹄瓣和柽柳5种盐生植物基因组DNA,通过与常规的CT AB法提取结果相比发现,改进的CT AB法从提取速度、得率、质量上都优于常规的CT AB法,并总结出一套适用于盐生植物的快速高质量基因组DNA的提取方法。
关键词 改进的CT AB法;盐生植物;DNA提取中图分类号:Q946.2 文献标识码:AM od i f i ed CTAB Protocol for Extracti n g the Tot a l D NA of Ha lophyte W ang Yanqin Luo Xiaoxia L iu Chen L i Xia Chen L iang Yang J ian (Key Laborat ory of Pr otecti on and U tilizati on of B i ol ogical Res ource in Tari m Basin of Xinjiang Pr oducti on&Constructi on Gr oup s,Tari m University,A lar,Xinjiang843300)(College of Plant Science and Techonl ogy,Tari m University,A lar,Xinjiang843300)Abstract T wo methods of DNA extracti on of s ome Hal ophytes were analyzed and compared.The results showed that the modified CT AB method was better than regular method in ter m s of the quality of t otal DNA extracti on.Key words modified CT AB method;Hal ophyte;DNA extracti on DNA的分离提取是进行植物分子生物学研究工作的基础,DNA样品质量是分子生物学实验成败的关键因素之一。
玉米DNA的小量快速提取
$BC!D3@ ! $BC!A4 循环 $D3@ !# $BC!,@保存 " !"#"$ %&’ 酶切反应体系 取 E’F 4 !5!加入 G6=H I 酶后用移液枪上下缓慢抽吸 3 > A 次进行混合 ! 加 &&<3= 至总体积为 3# !"! 然后将反应管放入 AD@
水浴锅中 !过夜 "
图! 小量法玉米 $%& 的 (&)$ 电泳图
测 " 结果发现 ./0 质量较好 " 所得的 ./0 可用于 405. 和 ./0 酶切等技术 # 此法具有提取速度快 $./0 质量好和 经济实用等优点 " 为玉米及其他植物 ./0 的提取提供了一个快速 $ 简便的途径 # 关键词 ! 玉米 %./0 提取 % 小量快速法 中图分类号 ! 6#!,1",#1, 文献标识码 ! 0
从图 ! 可以看出 ! 小量快速法提取的 E’F 有清 晰的主带 ! 也有少部分降解 ! 产生拖尾现象 ! 但总的 来说提取的 E’F 质量较好 "
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(&)$ 分析
将小量法 提 取 的 E’F! 用 于 HF)E 扩 增 ! 扩 增
产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图 3" 从 图 3 可 知 ! 小 量 快 速 法 提 取 E’F 可 用 于
>@A 实验方法 !"#"! $%& 的抽提方法
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本方法是在 COEKe9 等人],^
CV0_ 法提取植物 ./0](^"质量很好 "但较费时 " 一天
只能提取近百份材料 " 很难满足 664 $405. 等大规 模研究的需求 % 用小量快速法可克服以上两种方法 的缺点" 既有很快的提取速度" 又能获得较好的
辽宁师范大学
辽宁师范大学硕士研究生培养方案修订工作审批表（院级）注：培养方案上报研究生院前请完整填报本表，并签字盖章。
细胞生物学专业攻读硕士学位研究生培养方案一、培养目标本专业坚持正确的政治方向，具有团队精神和实事求是的科学品质。
掌握细胞生物学的基本理论和基本的实验技术；了解所研究领域的学术动态；熟练使用计算机；较为熟练掌握一门外语，能阅读本专业的外文资料并用外文撰写论文摘要。
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四、培养方式培养方式采取导师负责与导师组集体培养相结合的方式。
五、课程设置与学分（见课程设置表）第一类：必修课。
必修课包括三部分：㈠由研究生院统一组织开设的公共学位课；1．公共外语课，144学时，8学分，在第1、2学期开设，每周4学时，36周(注：外语类学科、专业的第二外语由外语学院安排)；2．公共政治课：⑴自然辩证法概论（理科），18学时，1学分，在第1学期开设，每周1学时，18周；⑵马克思主义与社会科学方法论（文科），18学时，1学分，在第1学期开设，每周1学时，18周；⑶中国特色社会主义理论与实践研究（文、理科），36学时，2学分，在第2学期开设，每周2学时，18周；3．教育基本理论问题研究（除教育学院外的课程与教学论专业），36学时，2学分，在第2学期开设，每周2学时，18周。
㈡由各学院组织开设的专业学位课，四门，每门54学时，3学分（合计12学分），分别在第1学期开设一门，第2学期开设一门，第3学期开设二门。
每学期18周，每周3学时；㈢由各学院组织开设的专业方向课，二门，每门36学时，2学分（合计4学分），分别在第2、3学期开设，每学期18周，每周2学时。
该课程应由导师为所指导的研究生指定。
第二类：选修课。
选修课包括两部分：㈠指定选修课专业外语，36学时，2学分，18周，每周2学时，在第3学期开设，由各学院组织开设（外语类学科、专业的研究生须在相应方向指定选修课程中选修2学分的课程）；㈡任意选修课专业选修课，2门。
不同控花周期对盆栽红掌品质的影响试验初报
上海农业科技王晖，等：不同控花周期对盆栽红掌品质的影响试验初报2021(2):72-74・园林与花卉•不同控花周期对盆栽红掌品质的影响试验初报王晖I王习习2肖博2霍文雨I（1中荷农业部上海园艺培训示范中心，上海201303；2上海鲜花港企业发展有限公司，上海201303）摘要：为探索不同盆径红掌的最佳控花周期，通过设置不同的控花周期，研究了控花处理对盆栽红掌品质的影响。
结果表明，控花处理能不同程度地增加4个盆栽红掌品种的株高、植株冠幅、花苞直径，且随着控花周期的延长，红掌的株高、植株冠幅、花苞直径明显增加，说明控花处理能促使盆栽红掌植株更加健壮。
但控花处理也在不同程度上减少了4个盆栽红掌品种的花苞数量。
关键词：盆栽红掌；控花周期；品质；影响中图分类号：S682红軾Anthurium andraeanum Linden）是天南星科花烛属多年生常绿草本植物，是当今世界上著名的盆栽花卉之一，因其花色艳丽、花形独特而深受人们的喜爱，具有极高的观赏价值和经济价值，市场潜力巨大一役但红掌在实际生产过程中，往往受气候条件的限制较大，例如，在冬季连续阴雨天环境下，盆栽红掌植株会因光合作用不足而能量短缺，出现花苞变小、株高瘦小等品质下降的现象卩41…有研究表明，红掌的花苞主要为消耗器官巴其极少进行光合作用，理论上将早期花苞摘掉，有利于节约植株能量，使更多的能量供给生长后期，从而使植株更加健壮「7」。
因此，笔者特对不同盆径的红掌进行控花处理，通过设置不同的控花周期，研究控花处理对盆栽红掌品质的影响，从而探索岀适合不同盆径红掌的最佳控花周期，进而为盆栽红掌生产提供一种控花处理方法。
现将相关试验结果报道如下。
1材料与方法1.1试验材料试验材料为2019年11月19日进苗的红掌穴盘幼苗，选择4个红掌品种，分别为适合种植于17cm 盆径的大株型品种“阿拉巴马”（Alabama）、“内华达”（Nevada）,适合种植于14cm盆径的中小株型品种"红斑比诺"（Bambinored）、"婉尼拉"（Vanilla）o先统一将生长健壮、长势一致的穴盘苗种植于9cm盆径的花盆中，基质均为纯泥炭。
上海交通大学2007年部分专业基础课参考书目
《流体力学》茅春浦上海交大出版社《工程流体力学》孔珑编水利电力出版社
458飞行力学
《高等飞行力学》（宋笔锋，高正红）西北工业大学出版社
461传感器与检测技术
《传感器》强锡富主编机械工业出版社
462细胞生物学（医学）
《医学细胞生物学》（第三版）宋今丹主编人民卫生出版社2004
463写作（含评论）
428电磁学和量子力学
《电磁学》赵凯华等高等教育出版社，占60%；《量子力学导论》曾谨言高等教育出版社，占40%
429兽医微生物学
《兽医微生物学》（第三版）陆承平主编中国农业出版社2001；《兽医免疫学》杜念兴主编中国农业出版社1997
430结构力学
《结构力学》龙驭球编高教出版社
431高分子化学与高分子物理
447空气动力学
《气体动力学基础》（潘锦珊）国防工业出版社，《空气动力学》（上、下册），（徐华舫，北京航空航天大学出版社）
448诉讼法学
（含刑事诉讼法学、民事诉讼法学）《刑事诉讼法》樊崇义主编法律出版社2004，《民事诉讼法》（面向二十一世纪课程教材）江伟主编高等教育出版社2004年第2版
449基础微生物学
《国际贸易》陈同仇薛荣久主编对外经济贸易大学出版社1997；《国际贸易理论、政策与实务》冯宗宪等主编西安交通大学出版社2004；《国际金融》陈雨露主编中国人民大学出版社2000
456马克思主义哲学原著
《关于费尔巴哈的提纲》、《费尔巴哈与德国古典哲学终结》、《反杜林论》哲学编，《唯物主义与经验批判主义》前三章，《矛盾论》，《实践论》
440信息系统分析与设计
《系统分析与设计方法》（System Analysis and Design Methods）第五版影印版（英文）Jeffrey L.whitten高等教育出版社2001
基因工程主要操作流程及图解
基因功能研究
通过动物模型研究基因在生物体内的功能及 其调控机制，揭示生命活动的本质。
动物模型构建方法和注意事项
构建方法：包括自然 突变筛选、化学诱变、 物理诱变和基因编辑 技术等。其中，基因 编辑技术如CRISPRCas9等已成为主流方 法。
注意事项
选择合适的动物种类 和品系，确保实验结 果的准确性和可重复 性。
基因工程主要操作流程及图解
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目 录
• 基因工程概述 • 基因工程基本操作流程 • 基因表达调控技术 • 蛋白质纯化与功能分析技术 • 细胞培养、转染和稳定株构建技
术 • 动物模型在基因工程中应用 • 总结与展望
01
基因工程概述
定义与发展历程
定义
基因工程是通过改变生物体的遗传物 质，来实现对生物性状和功能的定向 改造的一门技术。
通过基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）或基因重组技术将目的基因整合到细胞基因组中，实现稳定表达。
筛选方法
利用抗生素抗性基因或荧光标记基因进行初步筛选，再通过qPCR、Western blot等方法对稳定株进 行鉴定和验证。
06
动物模型在基因工程中应用
常见动物模型类型及其特点
小鼠模型
繁殖周期短，基因型确定，适合大规模遗传研 究。
转化细胞筛选与鉴定
01
02
03
抗性筛选
报告基因检测
PCR或测序鉴定
利用选择性培养基筛选转化细胞， 如抗生素或营养缺陷型培养基。
通过检测报告基因的表达情况， 间接判断目标基因是否整合到受 体细胞基因组中。
利用PCR或测序技术直接检测目 标基因在转化细胞中的存在和表 达情况。
03
基因表达调控技术
花粉管导入转基因的原理
花粉管导入转基因的原理花粉管通道法是是我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”报道的研究成果。
其原理是将外源DNA片段在作物受粉后特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿着花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期胚胎细胞。
花粉管通道法自问世以来，引起国际上的广泛关注，美、欧、亚等一些实验室将这一技术应用于稻、麦、棉、豌豆、牧草等基因重组和总DNA导入的研究中，其中在水稻、小麦等粮食作物上的应用比较多，在一定程度上拓宽了其种质基础，但在改良玉米育种中应用较少。
外源基因通过植物开花受精过程中形成的花粉管外通道导入胚珠转化受精的卵细胞,进而与受体细胞的基因组整合,随着受精卵的发育可以成为转基因新个体,这一技术称为花粉管通道法。
该技术由我国生物化学家周光宇创立,并经过许多研究者的共同努力发展起来的一种不依赖于组织培养的转基因技术,给那些植株再生有难度或组织培养体系还未建立的植物转基因育种带来了希望,即使对那些具有完善组织培养体系的物种,花粉管通道法也会大大降低其转基因育种的成本和操作难度,使植物的转基因育种更接近于生产化。
1981年首次利用该法成功培育出抗枯萎病棉花新品种后,迅速在小麦、水稻、大豆、玉米、烟草等重要农作物育种方面展开了广泛研究,转化率也由原来的10-2~10-1[4]提高到现在1%~16%。
有关花粉管通道法的概念、范畴及归属问题,在目前的研究报道中不完全一致。
王关林和方宏筠在《植物基因工程原理与技术》一书中指出,花粉管通道法、浸泡种胚转化法和子房注射法统称植物种质系统转化,其中花粉管通道法具体分为柱头涂抹法、柱头切除法、花粉粒携带法。
研究内容目前，花粉管通道法主要用于改良玉米自交系的研究主要集中在抗虫、抗除草剂以及提高植株抗逆性上，其中抗除草剂和抗Bt虫蛋白基因的研究成果显著，孟山都和先正达两个国际知名公司已将其推广应用于生产中。
植物基因工程中的常用启动子 _3231
植物基因工程中的常用启动子 _3231 植物基因工程中的常用启动子植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子(constitutive promoter )、诱导型启动子(inducible promoter) 和组织特异性启动子(tissue – specific promoter)。
这种分类大体上反映了它们各自的特点, 但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。
1 组成型启动子组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。
它包括异源和内源组成型启动子两类。
植物基因工程中应用的异源组成型启动子主要有CaMV35S启动子（来源于烟草花叶病毒基因），能在大部分植物中对异源基因进行启动表达，完整的CaMV35S启动子是植物基因工程中应用最为广泛的组成型启动子之一，如在马铃薯、拟南芥、烟草、蘑菇、毛白杨等植物中的转基因应用。
常用的还有来自农杆菌的Nos和Ocs启动子。
内源启动子主要有水稻肌动蛋白(actin)和玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子，这些启动子可以更有效地驱动外源基因在单子叶植物中的表达。
Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。
用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。
组成型启动子已经广泛地应用于双子叶植物、单子叶植物以及真菌等的基因工程中。
但是由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有表达，应用中逐渐暴露出一些问题。
例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡(karlowaki et al., 2003; Ehasani et al., 2003; Miyao et al., 2003)。
《植物基因工程》课件
REPORTING
抗虫抗病基因工程
抗虫基因工程
通过将抗虫基因导入植物，培育出具有抗虫性能的转基因植物，有效抵抗害虫的侵害，减少农药使用 ，保护生态环境。
抗病基因工程
通过导入抗病基因，提高植物对病原菌的抗性，降低植物病害的发生率，保障农作物产量和品质。
抗逆境基因工程
抗旱基因工程
转录因子调控
利用转录因子对目的基因进行表达调控，提高或降低基因的表达水平。
基因编辑技术
基因敲除
通过基因编辑技术，将目的基因从植 物染色体上删除或破坏，以实现功能 丧失或降低表达。
基因定点编辑
通过CRISPR-Cas9等基因编辑技术， 对目的基因进行定点突变、插入或缺 失，以实现功能获得或改变。
PART 03
的商业化应用开始。
目前，植物基因工程已经广泛应 用于农业、林业、园艺等领域， 为人类提供了大量的转基因作物
。
植物基因工程的应用领域
提高农作物的产量和品质
通过导入外源基因，改良植物的生长 发育和代谢过程，提高农作物的产量 和品质。
增强植物抗逆性
通过改变植物的抗病、抗虫、抗旱、 抗寒等性状，提高植物在逆境条件下 的生存能力。
合成生物学
合成生物学结合了基因工程和系统生 物学，未来可能实现定制化合成植物 基因组，为植物育种和改良提供新的 途径。
基因工程面临的ห้องสมุดไป่ตู้理和环境问题
伦理问题
基因工程技术的广泛应用可能对传统农业和 生态环境造成影响，引发关于人类干预自然 进程的伦理争议。
环境风险
转基因作物的种植可能对非目标生物和生态 环境产生不良影响，如基因漂移、生态失衡
通过基因工程手段增强植物的碳汇能力，为 减缓全球气候变暖做出贡献。
基因工程的应用前景
基因工程的应用前景摘要：介绍了植物基因工程和动物基因工程的研究内容。
基因的表达、植物基因工程在抗病虫害方面和动物基因在基因疫苗的应用、基因治疗的方法、基因的调控、基因调控的研究方法。
关键字：基因工程、基因表达、基因控制、基因疫苗、抗病虫害、基因治疗。
前言：近20年来，现代生物技术发展迅猛，在医药、农业、工业、环保等诸多领域显示出深远而广阔的应用前景。
目前，全球生物技术发展的基本格局是：美国占据了绝对优势，拥有世界上约一半的生物技术公司和一半的生物技术专利；西欧和日本属于第二层次，各国政府都在调动企业、学校等多方生物技术和生物工程资源，积极建立强大的生物技术基础研究基地；第三层次是古巴、以色列、韩国、印度等国，它们也投入到竞争行列。
生物技术的成长，为生物制品业发展提供了巨大的技术支持动力。
与发达国家相比，我国生物技术发展起步较晚，基础较差。
但随着我国政府的高度重视，特别是把现代生物技术列入国家“863”计划和重点科研攻关项目以来，我国生物技术行业取得了令人瞩目的成绩，总体水平和规模在发展中国家居于领先地位。
目前，我国从事生物技术研究开发的高校和科研院所约300家，公司约有300多家，科研人员超过2万人，资金总投入约为23.2亿元正文：在10世纪时中国发明了种痘术，用人痘接种法预防天花，这是人工自动免疫预防传染病的创始。
种痘不仅减轻了病情，还减少了死亡。
17世纪时，俄国人来中国学习种痘，随后传到土耳其、英国、日本、朝鲜、东南亚各国，后又传入美洲、非洲。
1796年英国人E.詹纳发明接种牛痘苗方法预防天花，他用弱毒病毒（牛痘）给人接种，预防强毒病毒（天花）感染，使人不得天花。
此法安全有效，很快推广到世界各地。
牛痘苗可算作第一种安全有效的生物制品。
微生物学和化学的发展促进了生物制品的研究与制作。
19世纪中期，“免疫”概念已基本形成。
1885年法国人L.巴斯德发明狂犬病疫苗，用人工方法减弱病毒的致病毒力，做成疫苗，被狂犬咬伤的人及时注射疫苗后，可避免发生狂犬病。