GST pull down的原理以及具体操作流程

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GST-pull-down实验技术原理和实验流程

3. 体外蛋白的结合
➢ 5、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层的Sepharose）；
➢ 6、重复步骤5三次; ➢ 7、吸干Sepharose上面的液体后，加入20~30微升1 ×蛋白电泳
上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃备用； ➢ 8、做SDS-PAGE和Western blot检测另一个蛋白。
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
➢ 1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子， 4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结合了His-B融合蛋白。
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
➢ 1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合了GST-A融合蛋白。
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：

GST pulldown实验技术

➢ 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备

GST pull-down实验

百泰派克生物科技
GST pull-down实验
GST pull-down实验原理
Pull-down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull-down技术利用被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的已知的蛋白特异性识别混合体系中的配体蛋白，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。

当诱饵蛋白被谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记时进行的Pull-down实验，称为GST pull-down实验，也称GST pull-down融合蛋白沉降技术。

GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。

GST pull-down实验应用
了解蛋白质间的相互作用可进一步探究某项生理活动的分子机制，GST pull-down 技术在研究不同生物体内蛋白相互作用方面得到了广泛的应用。

GST pull-down技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)可对相互作用蛋白进行定性定量分析，研究蛋白互作网络及由此介导的信号通路和调节机制。

百泰派克生物科技提供基于质谱的GST pull-down蛋白互作分析一站式服务，后续基于液质联用技术（LC-MS/MS）对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定。

欢迎免费咨询152-****7680。

gstpulldown实验流程

gstpulldown实验流程GST pull down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白相结合。

可用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用。

先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。

洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST pull down产物。

这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定出未知蛋白。

辉骏生物可制备GST融合蛋白，多种GST pulldown蛋白互作方案供客户选择，保证GST融合蛋白沉降技术服务到成功发表文献。

糖代谢异常是癌症的突出特征，作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中的糖原含量降低，并与患者总体生存情况不良相关。

探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。

>RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调，并与患者不良预后相关>细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长>GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制>Co-IP和GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能>CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体，GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化，稳定p53蛋白水平>荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子，通过p300介导的乙酰化，在转录水平上抑制GYS2>对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2本研究首次报道了HCC组织中糖原含量显著降低，并与不利的患者预后相关，这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。

GST pull-down实验技术

Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性

gst pull down原理

gst pull down原理Gst Pull Down原理Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。

这种技术可以提高视频的平滑度和流畅度，使观看体验更佳。

本文将详细介绍Gst Pull Down的原理。

一、什么是Gst Pull Down？Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。

在电影制作中，通常使用24帧/秒来拍摄和编辑电影。

但是，在播放时，大多数电视和显示器都以30帧/秒的速度播放视频。

因此，如果直接播放24帧/秒的电影，则会出现画面抖动或不流畅等问题。

二、为什么需要Gst Pull Down？在播放24帧/秒的电影时，由于每个画面之间存在较长时间间隔，因此画面会出现抖动或不流畅等问题。

而将24帧/秒转换为30帧/秒，则可以使画面更加平滑流畅，提高观看体验。

三、Gst Pull Down原理1. 3:2 Pulldown在进行Gst Pull Down时，通常采用3:2 Pulldown方法。

这种方法利用了电影制作中使用的24fps（frames per second）与NTSC （National Television System Committee）制定的30fps之间的差异。

具体来说，将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频，需要将每个电影画面分成两个半画面，然后再将其转换为三个NTSC画面。

2. 操作步骤具体来说，Gst Pull Down的操作步骤如下：（1）将24fps的电影分成两个半画面（Odd Field和Even Field）；（2）将Odd Field插入到第一帧和第二帧之间，形成一个新的NTSC 画面；（3）将Even Field插入到第三帧和第四帧之间，形成另一个新的NTSC画面；（4）重复以上步骤，直到所有24fps电影画面都被转换为30fps视频。

3. 效果通过Gst Pull Down处理后，原本24fps的电影就可以以30fps的速度播放，并且画面更加平滑流畅。

GST-pull-down实验原理与步骤

GST pull down实验原理与步骤GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。

此方法操作方便，简单易行。

GST pull down实验原理GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。

简单来说，我们假定a蛋白和b 蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST 的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。

通过Western blot检测结果，我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带，即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down（GST对照只显示一个条带）。

GST pull down实验步骤一、GST-a融合蛋白的制备1．GST-a融合蛋白的表达(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；(2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基（加入5ul氨苄）的10ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；(3)将培养菌液转移到含有500ml LB（含500ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200rpm培养数小时；(4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm 条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10min后弃去上清，再按每10ml菌液沉淀1ml PBS 的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。

GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）

GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。

GST-pull down 方案方法流程

GST-pull down 技术一大量制备GST蛋白1 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜2 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.63 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。

（IPTG 0.5mM，20℃,150rpm 培养10~16小时）4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。

（如需要该步沉淀能保存在-80℃）5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。

（50ul初始匀浆加入40ulPBS）三结合GST蛋白1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。

2 4℃，500g离心5min后弃上清3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS 洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)4 4℃，５00g离心5min后弃上清5 重复步骤3和4两次，共三次四预清除细胞裂解液1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。

GST-pull-down操作流程

GST pull down操作流程一、表达GST融合蛋白1、6mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜2、5ml菌液加入400ml LB＋Amp的1L锥形瓶中中，37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.83、取1ml菌液保存于Ep管中，sample14、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h5、取1ml菌液保存于Ep管中，sample26、诱导后的收菌，6000rpm×8min 4度，去尽上清，置于冰上7、加入20ml，－20度预冷的PBS+1%Triton-100+PMSF（1：100 PMSF）（先加15ml，再加5ml）吹打混匀8、（1）压力破碎仪破碎（2）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总20分钟。

至裂解液清澈9、14000rpm，20分钟，4℃离心，分离上清，取50ul sample310、取GST-Beads（400ul）到柱子管中，用预冷的PBS洗去其中的Triton－x－100，加上清（？），4度，旋转孵育1h如果是小量纯化，就是50ul的GST-beads放EP管，加细菌裂解液1ml11、收集50ul的样品sample4，可与sample3作对照，检测beads的结合效率12、用-20度预冷1％的Triton－x－100 in PBS洗3次，PBS洗3次1000转 2min，弃上清，留beads等体积的液体（小量PBS是1ml洗，多次）13、用大枪头剪去少许（beads：PBS=1:1）,吸出10ul跑样，检测纯化情况14、sample1，2，3，4加sample buffer，100度 10min，12000rmp 30sSDS－PAGE 每样10ul15、4度保存GST－pro-beads（如果不做pull-down,可以洗脱）sample1：诱导前sample2：诱导后sample3：上清sample4：纯化后上清二、裂解细胞1、收集细胞（胰酶处理好，防止细胞破碎）1000rmp，5min，RT2、PBS 洗，离心1000rmp，5min3、加400ul IP lysis buffer（0.1％Triton）1：100加cocktail冰上孵育 30minIP Lysis buffer 500ml：HEPES 5.95gNacl 4.38gEGTA 0.38gPH=7.44、针头过5次5、冰上，旋转孵育，15min6、14000rpm，20min，4度，留上清，去沉淀三、表达纯化HIS－tagged protein1、500ml LB 高温灭菌2、接种单克隆到5ml LB，加抗生素，37度，250转，过夜3、把菌液转移到500mlLB,加抗生素中，37度，250转，OD~0.7（看到云雾）4、加入IPTG 250－500ul，诱导4小时（温度摸索）5、6000转，4度，15min，弃上清，用10ml lysis buffer 溶解沉淀6、加入50ul PMSF，超声破碎，（300w，工作5，间歇10，全程10min）7、12000转，4度，20min8、柱中加入1ml ni-beads，上清转移至柱中，4度，旋转孵育1小时，（每种蛋白需要自行摸索相应的最佳条件，为防止蛋白降解，以下均在冰上）小量就是50ul的NI-beads放EP管，加细菌裂解液1ml9、用Wash buffer 1 10ml每次，洗2次（小量是1ml洗）用Wash buffer 2 5ml每次，洗2次（小量是1ml洗）收集洗脱液电泳检测每种wash buffer 的最佳用量（防止将蛋白洗脱）10、用Elution buffer洗脱蛋白2-4次，每次0.5ml，取1ul洗脱液在NC膜上，丽春红染色，颜色越深，蛋白量越大，取蛋白量最大的做Pull downLysis buffer50mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl10mMImidazoleWash buffer 150mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl20mM ImidazoleWash buffer 250mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl40mM ImidazoleElution buffer50mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl300mM ImidazoleElution buffer 40ml50mM NaH2PO4 0.312g300mM Nacl 0.701g300mM Imidazole 0.8171g三、pull down实验1、his-pro加入到已纯化的GST-Pro的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！2、4℃旋转结合，4h3、PBS+0.1%Triton-100洗3次，PBS洗3次，1000转 2min，1:1留。

GSTpulldown的原理以及具体操作流程

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST (Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH( Glutathione )亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离试齐U： NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Trit on-100 , IPTG(Merck 分装)，PMSF( Amersco)，Cocktaier ( Merck 539134 ), Immobilized Glutathione ( PIERCE 15160 )实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS 及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl : 8gKCl : 0.2gNa2HPO4: 1.44gKH2PO4 : 0.24g加入800ml蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！ 4 C保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟)MW:174.19工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM , 将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20 C或者4C(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)1:原核融合蛋白A的获得1.1 :将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37C培养过夜1.3:将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37C, 225rpm培养至OD60B 1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整).6000g, 10分钟，4C离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20 C 放置O/N1.4 :室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液 (PBS+1%Triton-100+PMSF ),吹打混匀1.5:冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

gstpull down实验原理

gstpull down实验原理GSTP（Global Software Test Platform）是一种基于客户端-服务器架构的软件测试平台，它可以实现分布式测试、自动化测试以及测试工具的集成。

GSTP的核心技术之一就是GSTPull Down实验原理。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，用于模拟客户端请求与服务器响应的交互过程。

通过这种方法，可以对服务器的性能、稳定性和负载能力进行评估和验证。

在GSTP中，GSTPull Down实验原理的主要步骤包括：构建测试用例、模拟客户端请求、发送请求到服务器、接收服务器响应、分析响应结果。

下面将对这些步骤进行详细描述。

构建测试用例是GSTPull Down实验原理的第一步。

测试用例是为了模拟真实的客户端请求，通常包括请求的类型、参数、路径等信息。

测试用例的设计要尽可能地贴近真实的使用场景，以保证测试结果的准确性。

接下来，通过模拟客户端请求，将测试用例发送到服务器。

在GSTP中，可以使用自定义的脚本或工具来实现请求的发送。

这些工具可以模拟不同的网络环境、请求频率和负载情况，从而对服务器的性能和稳定性进行全面测试。

服务器接收到客户端的请求后，会进行相应的处理，并生成相应的响应结果。

GSTP会将服务器的响应结果返回给测试者，以方便对响应结果进行分析和评估。

在分析响应结果时，可以根据预先设定的评估指标对服务器的性能进行评估。

评估指标可以包括响应时间、并发数、吞吐量等。

通过分析这些指标，可以了解服务器在不同负载下的性能表现，并找出潜在的性能瓶颈。

通过GSTPull Down实验原理，测试者可以对服务器的性能和稳定性进行全面的评估。

它可以帮助测试者发现服务器的性能瓶颈，优化服务器的配置和性能，提高服务器的负载能力。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，通过模拟客户端请求和服务器响应的交互过程，对服务器的性能和稳定性进行评估和验证。

GST pull-down原理及方法

看他是不是没有你不行, 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
Coimmunoprecipitatio的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.

gst pull-down实验流程

GSTPulldown实验流程一、实验准备阶段1.确定实验目的（1）确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题（2）定义所需的实验指标和结果参数2.准备实验材料（1）准备所需的细胞或组织样本（2）提取或购买GST标记的蛋白二、样品处理与制备1.细胞处理（1）处理细胞以获得所需的细胞提取物（2）对细胞提取物进行蛋白浓缩或纯化2.样品制备（1）将GST标记的蛋白与细胞提取物混合（2）进行样品预处理如加入缓冲液等三、GSTPulldown实验1.准备GSH亲和树脂（1）将GSH亲和树脂进行预处理和平衡（2）加入样品到GSH亲和树脂上2.亲和纯化（1）将混合样品与GSH亲和树脂一起孵育（2）清洗亲和树脂以去除非特异性结合物3.Elution（1）使用Elution缓冲液洗脱目标蛋白（2）收集洗脱的蛋白样品并保存四、蛋白分析与检测1.SDSPAGE分析（1）将洗脱的蛋白样品进行SDSPAGE电泳分析（2）观察蛋白条带的大小和清晰度2.Westernblot检测（1）将SDSPAGE分离的蛋白转移至膜上（2）使用特异性抗体进行GST标记蛋白的检测五、数据分析与结果解释1.带图像分析（1）分析SDSPAGE和Westernblot的图像（2）计算目标蛋白的相对含量和表达水平2.结果解释（1）根据实验结果解释GSTPulldown实验的结论（2）分析实验结果与预期结果的一致性和差异六、结果验证与文献探索1.实验验证（1）重复实验以验证结果的可重复性和稳定性（2）进行相关实验以进一步验证结论2.文献探索（1）检索相关文献并对实验结果进行比对和验证（2）吸收和借鉴相关研究的成果，完善研究结论。

GST-pull down

一、实验步骤1. 重组蛋白表达与纯化1）将将编码蛋白A的GST标签重组质粒转化到BL21或者Rosetta DE3感受态细胞中。

2）向高压灭菌的锥形瓶中倒入150 ml LB培养基，按照1:1000加入氨苄青霉素储液（工作浓度为50 μg/ml）。

用高压灭菌过的10 μl枪头挑取平板上的单克隆菌落，37℃条件下以200 rpm转速振荡培养约6 h，使OD600为0.6-0.8。

3）每管加入按照1:200-1:500加入IPTG（工作浓度为0.2-0.5 mmol/L），20-25℃条件下200 rpm继续振荡培养过夜。

4）4℃条件下4,000 rpm离心15 min，收集细菌沉淀。

a)尽量倒净上清，每管加入10 ml PBS缓冲液重悬细菌，置于冰上超声。

5）4℃，12,000 rpm离心30 min，留取上清并分装后（混匀）于-80℃保存，即为纯化的原核融合蛋白A。

2. GST-pull down实验1）将编码B蛋白的重组质粒转染入HEK293细胞中，48 h后提取细胞总蛋白。

2）留取50 µl蛋白加入2×蛋白样品缓冲液，混匀后100℃金属浴加热10 min使蛋白变性，室温12,000 rpm离心15 s，-20℃保存，作为Input。

3）用预冷PBS缓冲液洗涤Glutathione Sepharose 4B珠子，然后然后按照1:1的比例向Glutathione Sepharose 4B珠子中加入PBS缓冲液并混合均匀。

吸取珠子时应减掉枪尖部分，避免破坏珠子。

4）取适量纯化的原核融合蛋白A（SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色调整各个融合蛋白的蛋白量，如果有验证多个蛋白，比如截短蛋白，保证加到另一个蛋白里的蛋白量一样），加入30-40 µl预处理过的Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃颠倒混匀4-6 h。

5）于4℃条件下12,000 rpm离心15 s，弃上清。

大家都在做的GSTpull

大家都在做的GSTpull一、GST pull-down 基本知识1. GST pull-down 概念GST pull-down：是利用重组技术将探针蛋白与 GST 谷胱苷肽巯基转移酶融合，融合蛋白通过GST 与固相化在球珠上的GSH 谷胱甘肽结合。

从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。

2. GST pull-down 研究对象二、GST pull-down 原理1. GST pull-down 结合原理2. GST pull-down 分离原理三、GST pull-down 流程1. 蛋白的抽提与纯化：① 原核表达蛋白纯化② 真核表达蛋白抽提2. 体系孵育与 pull-down3. 考染检测与 WB 验证四、GST pull-down 结果1. GST pull-down 结果分析① 考马斯亮蓝检测② Western blot 验证五、GST pull-down 拓展1. GST pull-down 与 Co-IP 区别① GST pull-down② Co-IPGST pull-down 与 Co-IP 区别：GST pull-down 是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果，只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明；Co-IP 实验是细胞内高表达目的蛋白，并通过IgG 球珠-抗体-蛋白复合物体系，分离出互作的蛋白复合物，是细胞内的体内反应结合。

2. GST pull-down 实验优点① 可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。

② GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高。

3. GST pull-down 实验缺点① 验证互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。

② 融合表达的 GST 标签，肽链较长，可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

GST-pull-down试验方法(自己总结)

12.GST蛋白的表达和纯化12。

1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

(2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液.（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp）培养基中，使起始OD600为0.1。

(4）28℃，220rpm摇菌培养2小时.(5）加入50μl 100mM IPTG，16~27℃摇菌培养1～8小时。

（6) 收菌,将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。

（7）加入10ml PBS/管,重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清.（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管.（9）超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂（100x).破壁参数：Frequency：100～200w 60s， pause 20s run 40s，5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。

（10）将裂解液分入1。

5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

(11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm，1min）,取上清作SDS—PAGE电泳,检测表达情况。

12。

2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀.（2）取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3）加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min,弃上清。

反复5次。

（4）加500μl PBS，颠倒混匀，配成50％Glutathione Sepharose 4B备用。

12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B,4℃，摇床上摇，反应30min～60min。