标准菌种的管理与传代程序3333

1.0 目的 Purpose

标准菌种的管理与传代有一个比较规范的程序。

2.0 范围 Scope

上海11制药有限公司内的微生物实验室标准菌种的管理与传代。

3.0 适用文件 Applicable Document(s)

大肠杆菌检测标准操作程序…ChP法‟ SMB-102

铜绿假单胞菌检测标准操作程序…ChP法‟ SMB-103

金黄色葡萄球菌检测标准操作程序…ChP法‟ SMB-104

沙门菌检测标准操作程序…ChP法‟ SMB-105

大肠杆菌检测标准操作程序…JP法‟ SMB-112

铜绿假单胞菌检测标准操作程序…JP法‟ SMB-113

金黄色葡萄球菌检测标准操作程序…JP法‟ SMB-114

沙门菌检测标准操作程序…JP法‟ SMB-115

大肠菌群检测标准操作程序…Sankyo法‟ SMB-122

铜绿假单胞菌检测标准操作程序…Sankyo法‟ SMB-123

金黄色葡萄球菌检测标准操作程序…Sankyo法‟ SMB-124 革兰氏染色标准操作程序 SMB-001 培养基的营养试验 SMB-011 培养基配制与管理标准操作程序 SMB－007

4.0 相关部门 Responsible Section(s)

质量管理部

5.0 物件准备

5.1 设备与仪器

接种环，生物安全柜，-80℃冷冻冰箱，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌器，5℃

冰箱，1ml菌种冷冻管，放菌种冷冻管的盒子，塑封袋，标明菌种名称、接种

日期及接种人的标签纸，1ml加样枪，烧杯，试管及配套硅胶塞，显微镜、水

浴锅

5.2 试剂及菌种

大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢

杆菌、黑曲酶菌、10%甘油，灭菌生理盐水，革兰氏染色液、0.1%亚甲蓝液

（注：本公司购入的菌种标准分为ATCC和CMCC两种）

5.3 培养基

营养琼脂培养基，营养肉汤培养基、酪蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂

培养基、酵母霉菌琼脂培养基

6.0 操作步骤

6.1 10%甘油的制备：

将甘油配制成10%浓度的溶液，然后用1ml加样枪，将10%的甘油溶液加到

1ml菌种冷冻管中，盖上菌种冷冻管盖子，但不能将盖子拧紧。再将盖上盖子的菌种冷冻管放入烧杯内进行121℃、30分钟高压蒸汽灭菌。灭菌结束后，

将烧杯中的菌种冷冻管放入生物安全柜内，拧紧盖子放入放菌种冷冻管的盒子

内，再将盒子放入5℃冰箱保存，备用。

6.2标准菌种制备与管理

6.2.1 标准菌种冷冻管的制备（第一代）

将新购入的标准菌种在24小时内移入以上制备好的10％灭菌甘油

内。即从5℃冰箱取出已准备好的10%灭菌甘油菌种冷冻管置于生物

安全柜内，用冷却灭菌接种环从标准菌种斜面上挑取1～2个菌落接

种至10 %的灭菌甘油菌种冷冻管中，制成108的菌悬液，拧紧菌种冷冻管的盖子放入相配套的塑封袋中，同时放入该菌的标签纸，再将放有同一种菌的小的塑封袋放入一个较大的塑封袋中，放入－80℃带

锁的冰箱内。一般标准菌种在超低温冰箱内能保存5年，平均每年

每种菌用4支冷冻管，每三个月用一支冷冻管。

6.2.2第二、三代工作菌种的制备：

6.2.2.1从超低温冰箱中取出所需的菌种冷冻管，置于35～40℃的

水浴中进行解冻1分钟。

6.2.2.2 解冻后，放入生物安全柜内，用冷却后的灭菌接种环从冷冻

管中取一环菌液接种于10ml灭菌营养肉汤培养基中，置于

35～37℃的培养箱内18～24小时，进行增菌培养。…第二

代‟

6.2.2.3培养后，用冷却的灭菌接种环从增菌液中沾取一环接种于相

应的培养基斜面上贴上菌种标签，置于35～37℃的培养箱内

18～24小时，进行培养。…注：第三代接种出的斜面

数量是根据该月的该菌种的用量进行接种。菌种有效期以接

入斜面培养基日起一个月。‟

6.2.2.4 培养后，进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特征。确认

符合后置于5℃的冰箱内保存。使用时将培养出的斜面用

5ml的灭菌生理盐水将斜面上的菌落洗下制成108菌悬液使

用。…第三代‟

6.2.2.5在第三代菌种有效期内进行第四代的接种传代。

6.2.3 第四、五代工作菌种的制备：

6.2.3.1从5℃的冰箱内取出第三代工作菌种，用冷却的灭菌接种环

挑取1个菌落接种于相应的琼脂斜面培养基中，置于35～37

℃的培养箱内培养18～24小时后，进行革兰氏染色镜检同

时观察其菌落形态特征。确认符合后置于5℃的冰箱内作为

第四代工作菌种保存，备用。…注：第四代接种出的斜面数

量是根据该月的该菌种的用量进行接种的。菌种有效期以接

入斜面培养基日起一个月。‟

6.2.3.2 同上进行第五代工作菌种的接种传代。有效期以接入斜面培

养基日起一个月。

6.3 第三代ATCC工作菌种的管理与传代

6.3.1 第三代ATCC工作菌种环的管理

将新购入的菌种外包装上的菌种名称、批号、编号、有效期和供应商提

供的产品质量证书上的菌种名称、批号、编号、有效期进行核对。

核对无误后将菌种放入5℃的冰箱内保存。各菌种的产品质量证书归档

保存。此时保存于5℃冰箱内的菌种有效期按外包装上注明的有效期确

定。

6.3.2 第三代ATCC工作菌种的传代

6.3.2.1 第三代ATCC工作菌种的制备

由于本公司购入的第三代ATCC工作菌种是以接种环的形式保

存的，使用时我们将保存在5℃冰箱内的含有相应菌种的菌种

罐拿出，然后将含有菌种接种环的箔纸包装袋从罐中取出，一

个箔纸包装袋中装有一根接种环，最后在生物安全柜内将接种

环从箔纸包装袋中取出直接接种于相应的培养基斜面或平板

上，贴上菌种标签，置于35～37℃的培养箱内18～24小时，

进行培养。培养后，进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特

征，确认符合后放入5℃冰箱内保存，备用。…注：第三代接

种出的斜面数量是根据该月的该菌种的用量进行接种的，菌种

有效期以接种日起一个月。）

6.3.2.2 第四、五代ATCC工作菌种的制备：

6.3.2.2.1从5℃的冰箱内取出第三代ATCC工作菌种，用冷却的

灭菌接种环挑取1个菌落接种于相应的琼脂斜面培养

基中，置于35～37℃的培养箱内培养18～24小时后

进行革兰氏染色镜检并观察其菌落形态特征。确认其

符合后置于5℃的冰箱内作为第四代ATCC工作菌种保

存，备用。…注：第四代接种出的斜面数量是根据该

月的该菌种的用量进行接种的。菌种有效期以接种日