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基因工程

一、基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在

二、基因工程的基本工具

1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀”

2、DNA连接酶-----“分子缝合针”

3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车”

1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）存在：主要存在于原核生物中。

（2）特性：特异性，一种限制酶只能

识别一种特定的核苷酸序列，并且能在

特定的切点上切割DNA分子。

（3）切割部位：磷酸二酯键

（4）作用：能够识别双链DNA分子的

某种特定核苷酸序列，并且使每一条链

中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸

（5）识别序列的特点：

（6）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。

2．“分子缝合针”——DNA 连接酶

（1）作用：将限制酶切割下来的DNA 片段拼接成DNA 分子。 （2）类型

相同点：都连接磷酸二酯键

3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：

①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA 片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。

(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA 分子。

(3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用:

①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】

(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。

(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。

(5)不同DNA 分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA 分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。

(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA 分子，能将目的

种类 E ·coli DNA 连接酶

T 4DNA 连接酶 来源 大肠杆菌

T 4噬菌体

功能

特性

只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来

缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低

基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。

例1．限制酶MunⅠ和限制酶Eco RⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓AATTG－和－G↓AATTC－。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是（）

A

限制酶的应用特点

（1）在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但是如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。

（2）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端

五种酶的比较

作用底物作用部位形成产物

黏性末端或平末端

限制性内切酶DNA分子磷酸二酯键

DNA连接酶DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子

DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNA

DNA解旋酶DNA分子碱基对间的氢键脱氧核苷酸单链

RNA聚合酶核糖核苷酸磷酸二酯键核糖核苷酸单链

三、基因工程的操作步骤

1、目的基因的获取

2、基因表达载体的构建

3、将目的基因导入受体细胞

4、目的基因的检测与鉴定

1、目的基因的获取

获取目的基因的方法：

（1）直接分离法

从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA短片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包括基因组文库和cDNA文库。

直接从基因组中获取目的基因最常用的方法是：“鸟枪法”。

（2）人工合成法

化学合成法：片段较小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。

反转录法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）。

（4）利用PCR技术扩增目的基因

PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行，因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。

目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因

前提：要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。

2．基因表达载体的构建——基因工程的核心

(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

(3)基因表

达载体的构

建过程：

3．将目的基