“敏筛”说明书

Instruction manual (说明书)：

AllergyScreen过敏原检测试剂盒

1.用途

AllergyScreen过敏原定量检测系统采用免疫印迹方法，定量检测人血清中过敏原特异性IgE抗体。

2.概述

IgE免疫球蛋白发现始于1964年，它在I型变态反应发生机制中起重要作用。免疫应答时B淋巴细胞分化成熟为浆细胞，并合成和分泌不同类型的抗体。该过程由Th和Ts细胞调节，如果调节失控，通常不会造成损害的抗原也能激发免疫应答，刺激抗原特异性B细胞分化成熟为浆细胞，并产生IgE抗体, IgE抗体通过Fc段同嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面Fc受体结合。当同一变应原再次进入机体，直接作用于IgE，并通过它的决定簇与IgE分子Fab段间的结合，形成IgE 受体聚集成片,这些变化最终导致嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒释放组胺等生物活性物质，从而产生如麻疹`荨麻疹、皮炎、关节炎，枯草热（过敏性鼻炎）`哮喘及过敏性休克等典型的I型变态反应症状。

3.检测原理

特异性过敏原被吸附于硝酸纤维素膜表面，置于反应槽中。用移液器加入病人血清，室温下孵育，标本中过敏原特异性的IgE抗体与过敏原发生反应，并连接在硝酸纤维素膜上。将多余的抗体冲洗脱掉，再加入标记了生物素的抗人IgE 抗体，室温下孵育，冲脱未结合上的抗抗体。然后加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温下孵育，链霉亲和素和生物素结合。将未结合上的酶标链霉亲和素冲洗干净。当再加入BCIP/NBT酶作用底物并孵育后，碱性磷酸酶发生特定的酶显色反应，试剂条上出现沉淀。颜色深浅与血清中sIgE抗体含量成正比。待试剂条干燥后，CCD相机照相，读取检测结果。

4.检测系统组成

每套检测系统包括：

1×12 检测条：标记有20种过敏原的硝酸纤维素膜，置于塑料反应槽中（混合过敏原组，吸入组，食物组）

1×洗脱液：（TRIS/NaCl，包含0.1%NaN3）可稀释成1x500ml 的清洗液，pH=7.5 （20ml）

1×标记有生物素的抗人IgE抗体（白盖，多抗），含 0.1%NaN3 1×酶标链霉亲和素（红盖），连接有碱性磷酸酶的链霉亲和素1×底物（蓝盖），BCIP/NBT

12×加样吸管（300微升）

1×使用说明书

5.未提供的实验所需的其他工具

5.1稀释液

蒸馏水或去离子水

5.2 其他

搅拌器；量筒（500毫升），500毫升洗瓶，具10个不同板型的洗板机（也可无），避光的孵育箱（具体要求见MEDIWISS说明书）；水平混匀器；电吹风（也可无）；专用阅读仪（RAPID READER）和电脑（Windows98，Windows2000 ME或Windows2000 PROF 带USB接口）及打印机。

6.注意事项

本系统用于检测人血清中sIgE，所有患者血清都可能有传染性，操作时应采取相关防范措施。

由于抗抗体和洗脱液利用叠氮钠防腐，故应避免接触皮肤和粘膜。还应避免与铜或铅的容器接触，以免发生爆炸。

每次实验完毕，检测者应妥善处置各种废物。

所有接触过具潜在传染性的标本的器具，必须经消毒处理或在120℃高温下处理一小时以上。

不同批号的试剂组分不可互换使用。包装损坏或出现漏液的试剂，不应再使用。

7．储藏条件及有效期

检测条应置于阴凉，干燥，黑暗的塑料袋中。于2-8℃下保存，在有效期内使用。注意避免各种污染。稀释过的洗脱液在2-8℃下至多保存八周。

应避免底物受到链霉亲和素酶标物之污染而导致底物染色，结果错误。此外，底物必须避免阳光照射，以防分解或自动氧化造成染色。如果底物变色则不应再使用。

8．试剂稳定性

使用前若底物混浊变或呈紫色，说明试剂已变质，不能再使用。

9．标本采集和储存

本系统采用人血清为标本。静脉采血待血清自然析出或离心（4000G/转）10分钟。应避免使用反复冻融及被污染的标本。使用经加热灭活，脂血，溶血，黄疸及脂浊的血标本会导致结果的不正确。

标本在2-8℃下保存一周。若需保存更长时间，应置于-20℃以下储藏。

10.检测过程

10.1 概述

●使用前所有试剂及反应槽都应先恢复到室温(20-22℃)。试剂在使用前必须充

分混匀。结果的可重复性主要取决于准确的加样，严格地遵守孵育时间`温度和规范性地冲洗检测条。通常底物显色反应时，温度每升高1℃，反应时间应相应减少30秒钟。

●实验中应尽量避光，建议遮盖反应槽以避免蒸发损耗。拿反应槽时应避免接

触其表面，而握其手柄。病人资料（如编号）可以贴在手柄上。

●严格按说明书操作，否则孵育时间和温度的偏差会导致标本的结果错误。

●底物孵育必须在暗箱中操作，以免底物自动显色。

严格按照检验室规程工作。

10.2 清洗液的制备

将洗脱液置于500ml的量筒内，加满蒸馏水，充分搅拌混匀，并转移到洗瓶中。如果需要，可37℃水浴溶解洗脱液中的结晶。

10.3 初次孵育

将实验所需的检测条从包装内取出，用稀释过的洗脱液冲洗几秒钟，用加样器取250µl患者血清，注意每加一份血清就更换一个加样器头。置于混匀器（120次振动/分钟）上室温（20-22℃）孵育45分钟。

10.4 冲洗

反应槽用洗脱液冲洗5秒钟，上下转动，使清洗液充分流过检测条。轻轻晃动可以增强清洗效果。如使用自动化洗板机此过程可简化。

10.5 二次孵育

在每个反应槽中加入250µl的抗抗体，仍放在混匀器上室温孵育45分钟。

10.6 冲洗

过程同10.4。

10.7 第三次孵育

加入250µl链霉亲和素酶标物，混匀器上室温孵育20分钟。

10.8 冲洗

过程同10.4。

10.9 第四次孵育

加入250µl底物在反应槽内，混匀器上室温孵育20分钟后，流水冲洗试剂条，即发生酶变色反应。空气干燥或用电吹风加快干燥，当蓝紫色的背景消失时说明试剂条已完全干燥，才能进行读数。

操作步骤总结：

A. 系统恢复到室温（20-22℃）。

B .用蒸馏水以1：25稀释洗脱液。

C. 用清洗液湿润硝酸纤维素膜，在检测板上加入250µl的血清标本，在混匀

器（120振/分）上室温孵育45分钟。

D. 冲洗，手持反应槽上下翻转让清洗液充分流过，轻晃会增加效果。

E. 加入250ul抗抗体，在混匀器上室温孵育45分钟。

F. 冲洗（同D）

G. 加250ul链霉亲和素标记物，在混匀器上室温孵育20分钟。

H. 冲洗（同D）

I. 加入250ul底物，在混匀器上室温孵育20分钟