蛋白质的修饰和表达
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二、蛋白质功能的全新设计
• 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的 结构和有用的功能。功能设计主要涉及键合 及催化
• 为达到这些目的可以采用两条不同的途径： 反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功 能；从头设计功能蛋白质
蛋白质的功能设计
１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能
２．键合及催化的从头设计
• 非共价缔合
在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链 并不因此分开，仍能保持其生物学活性。 在变性系统中，破坏非共价键后，在非变 性基质中仍可形成原来的构型，活力也随 之恢复。这一现象可用来产生半合成的类 似物
• 产生二硫键 二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开 DTT、 二硫苏糖醇 将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一 肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌 合分子
基于抗生素抗性“回复”的突变方法
多克隆位点
Tetr Amps Tetr Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
• 形成肽键 通过酶连接反应形成肽键 从猪胰岛素生产人胰岛素 将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白 酶）
通过酶法与活性酯偶联 羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子
• 产生非天然型共价键 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。 常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子 中的赖氨酸残基侧链相连接。
可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体 如：抗体 制备具有不同功能的F（ab)2的类似物
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
氧化和还原反应
• 二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二 硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处 理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要 经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。 • 5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与 巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离 子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。 Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂， 还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状 态及跟踪构象变化的过程。
３．在全新蛋白质中引入结合位点
４．催化活性蛋白质的设计
５．膜蛋白及离子通道的设计
６．新材料的设计
第四章 蛋白质的修饰和表达
• 蛋白质修饰的化学途径 • 蛋白质修饰的分子生物学途径
氨基的化学修饰
• 三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm 和367nm能够产生特定的光吸收。 • 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。 • α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
寡核苷酸引物介导的定点突变的改进
缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲 基介导的碱基错配修复系统 改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA 特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体 2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的 步骤 3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多 对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变
来自百度文库
寡 核 苷 酸 引 物 介 导 的 定 点 突 变 的 改 进
U
Kunkel方法
3’ U
U
模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶 尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株 ungdUTP酶缺陷突变体 dut-
U
转染ung+ 模板链降解
U
U 关键技术步骤：制备高质量的含U的单链DNA模板 宿主：E.coli CJ 236品系
5’
3’
3’
5’ 3’ 3’
5’
5’
盒式突变
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突 变序列的寡核苷酸片断，取代野生型基因 中的相应序列，设计成粘性末端 • 步骤： 1、将克隆片断用限制性内切酶切割 2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片 断混合 3、产生突变基因产物
随机突变 优点：在体外模拟自然进化的过程 常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNA family shuffling)等
寡核苷酸引物介导的定点突变
1、将待突变基因克隆到突变载体上 2、制备含突变基因的单链模板; 3、引物与模板退火，以5’端磷酸化的突变寡核苷酸引 物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双 链的DNA, 4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA 为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口, 产生闭环的异源双链的DNA分子; 5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产生野生型、 突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选 6、对突变基因序列进行分析
二、蛋白质改造的分子生物学途径
• 蛋白质改造的分子生物学方法
突变： 寡核苷酸介导的定向突变、 PCR方法、盒式突变 定向进化：异错PCR、基因家族改组技术
• 表达体系
原核表达：大肠杆菌 真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞
定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一 定长度的核苷酸片断 优点：突变率高、简单易行、重复性好 应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结 构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理 方面研究 应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导 的定点突变及盒式突变
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件 • 2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力 的基团所处的可反应和不可反应的离子状 态。 • 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶， 但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造 （或化学修饰）的多肽相缔合 非共价缔合 产生二硫键 形成肽键 产生非天然型的共价键
• 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的 结构和有用的功能。功能设计主要涉及键合 及催化
• 为达到这些目的可以采用两条不同的途径： 反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功 能；从头设计功能蛋白质
蛋白质的功能设计
１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能
２．键合及催化的从头设计
• 非共价缔合
在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链 并不因此分开，仍能保持其生物学活性。 在变性系统中，破坏非共价键后，在非变 性基质中仍可形成原来的构型，活力也随 之恢复。这一现象可用来产生半合成的类 似物
• 产生二硫键 二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开 DTT、 二硫苏糖醇 将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一 肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌 合分子
基于抗生素抗性“回复”的突变方法
多克隆位点
Tetr Amps Tetr Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
• 形成肽键 通过酶连接反应形成肽键 从猪胰岛素生产人胰岛素 将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白 酶）
通过酶法与活性酯偶联 羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子
• 产生非天然型共价键 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。 常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子 中的赖氨酸残基侧链相连接。
可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体 如：抗体 制备具有不同功能的F（ab)2的类似物
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
氧化和还原反应
• 二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二 硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处 理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要 经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。 • 5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与 巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离 子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。 Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂， 还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状 态及跟踪构象变化的过程。
３．在全新蛋白质中引入结合位点
４．催化活性蛋白质的设计
５．膜蛋白及离子通道的设计
６．新材料的设计
第四章 蛋白质的修饰和表达
• 蛋白质修饰的化学途径 • 蛋白质修饰的分子生物学途径
氨基的化学修饰
• 三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm 和367nm能够产生特定的光吸收。 • 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。 • α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
寡核苷酸引物介导的定点突变的改进
缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲 基介导的碱基错配修复系统 改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA 特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体 2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的 步骤 3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多 对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变
来自百度文库
寡 核 苷 酸 引 物 介 导 的 定 点 突 变 的 改 进
U
Kunkel方法
3’ U
U
模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶 尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株 ungdUTP酶缺陷突变体 dut-
U
转染ung+ 模板链降解
U
U 关键技术步骤：制备高质量的含U的单链DNA模板 宿主：E.coli CJ 236品系
5’
3’
3’
5’ 3’ 3’
5’
5’
盒式突变
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突 变序列的寡核苷酸片断，取代野生型基因 中的相应序列，设计成粘性末端 • 步骤： 1、将克隆片断用限制性内切酶切割 2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片 断混合 3、产生突变基因产物
随机突变 优点：在体外模拟自然进化的过程 常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNA family shuffling)等
寡核苷酸引物介导的定点突变
1、将待突变基因克隆到突变载体上 2、制备含突变基因的单链模板; 3、引物与模板退火，以5’端磷酸化的突变寡核苷酸引 物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双 链的DNA, 4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA 为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口, 产生闭环的异源双链的DNA分子; 5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产生野生型、 突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选 6、对突变基因序列进行分析
二、蛋白质改造的分子生物学途径
• 蛋白质改造的分子生物学方法
突变： 寡核苷酸介导的定向突变、 PCR方法、盒式突变 定向进化：异错PCR、基因家族改组技术
• 表达体系
原核表达：大肠杆菌 真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞
定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一 定长度的核苷酸片断 优点：突变率高、简单易行、重复性好 应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结 构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理 方面研究 应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导 的定点突变及盒式突变
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件 • 2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力 的基团所处的可反应和不可反应的离子状 态。 • 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶， 但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造 （或化学修饰）的多肽相缔合 非共价缔合 产生二硫键 形成肽键 产生非天然型的共价键