生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）
1、试剂配制
去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备
土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表
6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口
（图6–1 土壤熏蒸抽真空装置）
3、操作步骤
（1）土样前处理
新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。

测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。

如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不
结块为宜），风干过程中应经常翻动，以避免局部干燥。

如土样过于干燥，用去离子水调节含水量至田间持水量的40%。

将土样置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1mol L-1 NaOH溶液以吸收产生的CO2。

土壤田间持水量的测定按Shaw（1958）方法改进。

在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗内放一层玻璃纤维，取50g土样于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50ml水，保持30min。

再打开夹子使多余的水流入量筒，30min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量。

（2）熏蒸
称取经前处理相当于50.0g烘干基的新鲜土样3份，置于80ml烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3只，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度。

按图6–1装置抽真空，也可采用无油真空泵（如DOA-P181-BN型真空/正压泵），真空度控制在–0.07Mpa以下，使氯仿剧烈沸腾3～5min。

关闭真空干燥器阀门，在25℃暗室放置24h。

熏蒸结束打开干燥器阀门时应听到空气进入的声音，否则为熏蒸不彻底，应重做。

取出氯仿（氯仿到回贮存瓶，可再使用）和稀NaOH溶液的烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（–0.07Mpa；5～6次，每次3min）直到土壤无氯仿味为止。

每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加快去氯仿的速度。

熏蒸的同时，另称取等量的土样3份，置于另一干燥器中但不熏蒸，作为对照土样。

（3）提取
将熏蒸土样无损地转移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4（土水比为1 : 4；w : v），振荡30min（300r min-1），用中速定量滤纸过滤于125ml塑料瓶中。

熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土样于200ml聚乙烯提取塑料瓶中，直接加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4提取；另外作3个空白。

提取液应立即分析，或在–18℃下保存。

注意提取液保存时间过长（>20h），会导致有机碳的测定结果下降。

低温（–18℃）下保存的土壤提取液，解冻后会出现一些白色沉淀（CaSO4或K2SO4结晶），对有机碳测定没有影响（Brookes 等，1985），不必除去，但取样前应充分摇匀。

（4）测定
取10ml土壤提取液于40ml样品瓶中（注意解冻的提取液在取样前应彻底混匀），加入10ml六偏磷酸钠溶液（pH2.0），于碳–自动分析仪（Phoenix 8000）上测定有机碳含量。

工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，去离子水定容，即得0、20、40、60、80、100mg C L-1系列标准碳溶液，按上述方法测定。

（5）结果计算
土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC
式中：E C为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EC为转换系数，取值0.45（Wu等，1990）。

二、土壤微生物生物量氮测定方法（熏蒸提取－全氮测定法）
1、试剂配制
去乙醇氯仿：同上。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：同上。

硫酸铜溶液[c（CuSO4）= 0.19mol L-1]：30.324g分析纯硫酸铜溶于去离子水，定容至1L。

氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10mol L-1]：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，定容至1L。

氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4mol L-1]：160g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，定容至1L，抽滤（0.45µm微孔滤膜）。

指示剂贮存液：0.500g氨混合指示剂溶于5.0ml 0.01mol L-1 NaOH和5.0ml 95%乙醇混合液，用去离子水定容至100ml。

该贮存液使用期为1个月。

指示剂溶液：10ml指示剂贮存液用去离子水稀释至500ml，抽滤（0.45µm微孔滤膜）。

注意：该溶液应使用的前1天配制，最多可使用1周。

氯化铵标准贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000µg N ml-1]：3.8190g分析纯氯化铵（称量前105℃烘2～3h）溶于去离子水，并定容至1L。

该贮存液在4℃下可稳定保存数月。

氯化铵标准溶液[ρ（NH4Cl）= 50µg N ml-1]：10ml 1000µg N ml-1氯化铵贮存液用去离子水稀释至200ml。

该溶液最多保存7d。

2、仪器设备
流动注射氮分析仪（FIAStar5000）或定氮仪、pH自动滴定仪、真空抽滤瓶，微孔膜（<0.45µm）、容量瓶（100ml）、其他仪器设备同上。

3、操作步骤
（1）土样前处理、熏蒸和提取
同上。

（2）消化
取15.0ml上述提取液于250ml消化管中，加入0.3ml 0.19mol L-1硫酸铜溶液、5ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物，混合液消化变清后再回流3h。

（3）消化液中氮测定
消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100ml容量瓶中，至体积大约为70ml；待冷却后缓慢加入10ml 10mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀，以免因局部碱浓度过高而引起NH3的挥发损失，冷却后用去离子水定容至100ml。

溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar5000）测定。

采用40µl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂Ⅰ为4mol L-1 NaOH 溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。

标准工作溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 50µg N ml-1氯化铵标准溶液于100ml容量瓶中，再分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样液。

用去离子水定容至100ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5µg N ml-1系列氯化铵标准工作溶液，同上测定。

其他具体操作参见仪器使用说明。

（4）结果计算
土壤微生物生物量氮：B N = E N / k EN
式中：E N 为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EN为转换系数，取值0.45（Jenkinson，1988；Brookes等，1985b）。

微生物生物量碳氮:
土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC
式中：E C为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EC为转换系数，取值0.45
其中：E C1=(TOC值-CK)*{浸提液体积+湿土重*含水量/(1+含水量)}/{湿土重/(1+含水量)}
=(TOC值-CK)*{浸提液体积*(1+含水量)+湿土重*含水量}/湿土重
含水量=水重/干土重
E C1为熏蒸或不熏蒸土样中每g干土中的碳含量
土壤微生物生物量氮：B N = E N / k EN
式中：E N 为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EN为转换系数，取值0.45
其中：E N’=FIA值-CK)*{浸提液体积+湿土重*含水量/(1+含水量)}*（定容体积/消化液体积）/{湿
土重/(1+含水量)}=(FIA值-CK)*{浸提液体积*(1+含水量)+湿土重*含水量}*（定容体积/消化液体积）/湿土重
含水量=水重/干土重
E N’熏蒸或不熏蒸土样中每g干土中的氮含量。