生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量碳测定方法
土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳( Soil microbial biomass )不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分(如氮、磷和硫等)的保持和释放及其植物有效性。
近40 年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。
由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc) 来表示土壤微生物生物量的大小。
测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法 (Fumigation-incubation, FI )和熏蒸提取法( Fumigation-extraction, FE )。
熏蒸提取法(FE法)由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。
Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol • L-1K2SQ提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。
Vance 等(1987) 建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol ・L-1&SQ提取剂(水土比1: 4)直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC(取值0.38)来计算土壤微生物碳。
Wu等( 1990)通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取一一碳自动一起法测定土壤微生物碳。
该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。
林启美等(1999)对熏蒸提取- 重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。
对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC的取值，有很多研究进行了大量的研究。
测定K EC值的实验方法有：直接法(加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物)和间接法(与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较)。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。
之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。
2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。
使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。
上述处理均在通风橱里操作。
3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。
若是气密性不好，使用少些凡士林密封。
步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。
2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。
3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。
4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样 6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
生物量碳氮测定方法
生物量碳氮测定方法
熏蒸提取法首先需要标定氯仿和浓硝酸的用量。
氯仿用于提取生物样品中的有机碳，而硝酸用于氧化有机物质并释放出氮。
实验过程中，首先将称量好的生物样品放入一个带有砂浴和回流装置的烧瓶中，并加入适量的硝酸和氯仿。
然后，用火焰加热烧瓶，使溶液进行蒸发和浓缩。
随着溶液的蒸发，有机物质被转化为气体，并被冷凝在装有冷冻剂的收集瓶中。
在冷凝过程中，氯仿中的有机碳会沉积在冷凝瓶底部。
完成冷凝后，将氯仿从冷凝瓶中转移到预先称量的烧瓶中，然后再进行蒸发和浓缩，直到氯仿蒸发殆尽。
最后，将烧瓶中残余的有机物质转移到燃烧船中，放入燃烧炉中进行燃烧。
燃烧后，生成的CO2和N2通过吸收器中的饱和硫酸被捕获，并被转移到室外的装有碱液的收集瓶中。
碱液中的CO2被氢氧化钠中和，并转化为氢氧化钠。
通过在吸收瓶中加入酚酞指示剂，可以测定CO2的体积。
测定氮的过程与测定碳类似，只是在蒸发过程中释放的气体被洗涤瓶中的含硼酸溶液捕集。
然后将含硼酸溶液转移至定容瓶中，用碱液进行中和，再用氯化亚铁标准溶液滴定，从而可以测定氮的含量。
通过测定生物样品中CO2和N2的体积，以及标定剂量和无机碳和氮的含量，可以计算出生物样品中的有机碳和氮的含量。
总的来说，熏蒸提取法是一种通过加热蒸发和燃烧的方法，将生物样品中的有机物质转化为气体或溶液，并通过捕集和测定气体体积的方式，来测定生物体内的碳和氮含量。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定方法微生物量、碳氮测定方法是研究微生物数量和代谢活性的关键手段，可用于土壤、水体和生物体等环境中的微生物研究。
常用的微生物量、碳氮测定方法包括显微镜计数法、流式细胞术、气体产量法、碳氮比测定法等。
下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。
一、显微镜计数法显微镜计数法通过显微镜观察和计数微生物的数量来测定微生物量。
其原理是将样品置于显微镜下，在显微镜下观察样品中的微生物数量，并进行计数。
根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中微生物的数量。
显微镜计数法的操作步骤如下：1.获取样本并制备薄片。
根据需要采集样本，并将样本制备成薄片或涂片。
可以使用高温固定、化学固定或热固定等方法固定样本。
2.显微镜观察和计数。
将固定的样本放入显微镜下，通过放大镜头观察样本中的微生物，并进行计数。
为了避免重复计数和遗漏计数，可以使用方格计数器。
3.根据计数结果计算微生物量。
根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中的微生物数量。
通常计算结果以每克（或每升）样品中的微生物数量表示。
二、流式细胞术流式细胞术是用于计数、分类和分析微生物的一种高通量、高精读的方法。
其原理是将样品中的微生物通过细胞色素或抗原标记，通过流式细胞仪进行激光扫描，扫描到的细胞信号通过计算机进行分析，从而得到微生物的数量、大小和类型等信息。
流式细胞术的操作步骤如下：1.准备样品和染色。
根据需要采集样本，并给样本进行染色。
染色可以使用细胞色素或抗原标记法，将需要测定的微生物区分出来。
2.流式细胞仪扫描。
将染色的样品装入流式细胞仪中，通过激光扫描仪器扫描染色的细胞，并记录扫描到的细胞信号。
3.数据分析。
通过计算机分析扫描到的细胞信号，得到微生物的数量、大小和类型等信息。
三、气体产量法气体产量法是通过测定微生物代谢过程中产生的气体来间接测定微生物的数量和代谢活性。
常用的气体产量法有氧呼吸测定法和甲烷产量测定法。
气体产量法的操作步骤如下：1.准备培养基和反应器。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。
1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。
2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。
直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。
直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。
现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。
本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。
二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。
二、试剂1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。
将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。
2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。
四、操作步骤称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。
将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。
抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。
熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。
另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。
将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。
测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。
二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。
用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。
向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。
静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。
2.抽气。
用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。
干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。
另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。
在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。
盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。
把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。
3.排出氯仿。
取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。
4.另筛取250g土壤，不熏蒸。
分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。
调节土壤水分至罪大含水量的55％。
将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。
在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。
5.滴定。
取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。
从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。
再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。
.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法熏蒸提取法是一种常用的微生物碳氮测定方法，主要用于土壤、沉积物和水体等环境样品中微生物碳氮的测定。
该方法的原理是通过熏蒸操作将样品中的微生物碳氮转化为气态的有机碳和氨氮，然后采用适当的仪器进行测定。
熏蒸提取法的操作步骤如下：1.制备样品：首先需要将待测样品进行适当处理，例如将土壤样品通过筛网筛分细粒土壤，去除杂质并获得均匀的样品。
2.准备熏蒸试剂：通常采用硝酸钠和过氧化氢作为熏蒸试剂。
将一定量的硝酸钠和过氧化氢溶解在适量的蒸馏水中，制备成一定浓度的熏蒸试剂。
3.装填样品：将经过处理的样品装填入适当的装填容器中，容器的底部通常需要加入一层石蜡以防止样品颗粒溢出。
4.装置熏蒸装置：将装填好样品的容器放入熏蒸装置中，使其与熏蒸试剂充分接触，并保证装置的密封性。
5.熏蒸操作：打开熏蒸装置，让熏蒸试剂蒸气渗透到样品中。
通常可以通过加热和搅拌等方法加快熏蒸的速度。
6.采样：在一定时间的熏蒸后，关闭熏蒸装置，将装填容器取出。
此时，样品中的微生物碳氮已经转化为气态的有机碳和氨氮。
可以通过适当的方法（例如吸附管）采样气相中的有机碳和氨氮。
7.测定：采集好的气相样品可以通过气相色谱、气相质谱等方法进行测定。
有机碳和氨氮的含量可以通过标准曲线或其他相关方法得到。
熏蒸提取法在微生物碳氮测定中具有一定的优点和适用性：1.简便快捷：相对于其他常用的微生物碳氮测定方法，熏蒸提取法操作简单，只需经过几个基本步骤即可得到气相样品。
2.高效准确：熏蒸提取法可以将样品中的微生物碳氮充分转化为气态，提高了测定效率和准确性。
3.适用范围广：熏蒸提取法可以应用于多种环境样品的微生物碳氮测定，如土壤、沉积物和水体等。
4.可检测多种有机碳和氨氮：通过熏蒸提取法得到的气相样品中可以同时测定多种有机碳和氨氮的含量，使分析更加全面。
当然，熏蒸提取法也存在一些局限性：1.适用样品有限：由于熏蒸提取法需要样品能够充分接触熏蒸试剂，对于一些粘稠或颗粒较大的样品，可能会影响熏蒸的效果。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。
之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。
2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。
使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。
上述处理均在通风橱里操作。
3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。
若是气密性不好，使用少些凡士林密封。
步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。
2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。
3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。
4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。
土壤微生物量碳测定方法
土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。
近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。
由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。
测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。
熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加-1入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。
Voroney(1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·LK2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。
Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol·L-1K2SO4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC(取值0.38)来计算土壤微生物碳。
Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。
该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。
林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。
对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的14研究。
测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法work Information Technology Company.2020YEAR二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法1．主题内容与适用范围本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。
2．方法提要土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
3．提取液的制备3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜3.2试剂的制备：0.5 M K2SO4溶液（化学纯）、无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积比2:1于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）3.3分析步骤：3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口（图6–1 土壤熏蒸抽真空装置）3、操作步骤（1）土样前处理新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。
测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。
如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜），风干过程中应经常翻动，以避免局部干燥。
如土样过于干燥，用去离子水调节含水量至田间持水量的40%。
将土样置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1mol L-1 NaOH溶液以吸收产生的CO2。
土壤田间持水量的测定按Shaw（1958）方法改进。
在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗内放一层玻璃纤维，取50g土样于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50ml水，保持30min。
再打开夹子使多余的水流入量筒，30min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量。
（2）熏蒸称取经前处理相当于50.0g烘干基的新鲜土样3份，置于80ml烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3只，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度。
按图6–1装置抽真空，也可采用无油真空泵（如DOA-P181-BN型真空/正压泵），真空度控制在–0.07Mpa以下，使氯仿剧烈沸腾3～5min。
关闭真空干燥器阀门，在25℃暗室放置24h。
熏蒸结束打开干燥器阀门时应听到空气进入的声音，否则为熏蒸不彻底，应重做。
取出氯仿（氯仿到回贮存瓶，可再使用）和稀NaOH溶液的烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（–0.07Mpa；5～6次，每次3min）直到土壤无氯仿味为止。
每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加快去氯仿的速度。
熏蒸的同时，另称取等量的土样3份，置于另一干燥器中但不熏蒸，作为对照土样。
（3）提取将熏蒸土样无损地转移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4（土水比为1 : 4；w : v），振荡30min（300r min-1），用中速定量滤纸过滤于125ml塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土样于200ml聚乙烯提取塑料瓶中，直接加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4提取；另外作3个空白。
提取液应立即分析，或在–18℃下保存。
注意提取液保存时间过长（>20h），会导致有机碳的测定结果下降。
低温（–18℃）下保存的土壤提取液，解冻后会出现一些白色沉淀（CaSO4或K2SO4结晶），对有机碳测定没有影响（Brookes 等，1985），不必除去，但取样前应充分摇匀。
（4）测定取10ml土壤提取液于40ml样品瓶中（注意解冻的提取液在取样前应彻底混匀），加入10ml六偏磷酸钠溶液（pH2.0），于碳–自动分析仪（Phoenix 8000）上测定有机碳含量。
工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，去离子水定容，即得0、20、40、60、80、100mg C L-1系列标准碳溶液，按上述方法测定。
（5）结果计算土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC式中：E C为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EC为转换系数，取值0.45（Wu等，1990）。
二、土壤微生物生物量氮测定方法（熏蒸提取－全氮测定法）1、试剂配制去乙醇氯仿：同上。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：同上。
硫酸铜溶液[c（CuSO4）= 0.19mol L-1]：30.324g分析纯硫酸铜溶于去离子水，定容至1L。
氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10mol L-1]：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，定容至1L。
氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4mol L-1]：160g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，定容至1L，抽滤（0.45µm微孔滤膜）。
指示剂贮存液：0.500g氨混合指示剂溶于5.0ml 0.01mol L-1 NaOH和5.0ml 95%乙醇混合液，用去离子水定容至100ml。
该贮存液使用期为1个月。
指示剂溶液：10ml指示剂贮存液用去离子水稀释至500ml，抽滤（0.45µm微孔滤膜）。
注意：该溶液应使用的前1天配制，最多可使用1周。
氯化铵标准贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000µg N ml-1]：3.8190g分析纯氯化铵（称量前105℃烘2～3h）溶于去离子水，并定容至1L。
该贮存液在4℃下可稳定保存数月。
氯化铵标准溶液[ρ（NH4Cl）= 50µg N ml-1]：10ml 1000µg N ml-1氯化铵贮存液用去离子水稀释至200ml。
该溶液最多保存7d。
2、仪器设备流动注射氮分析仪（FIAStar5000）或定氮仪、pH自动滴定仪、真空抽滤瓶，微孔膜（<0.45µm）、容量瓶（100ml）、其他仪器设备同上。
3、操作步骤（1）土样前处理、熏蒸和提取同上。
（2）消化取15.0ml上述提取液于250ml消化管中，加入0.3ml 0.19mol L-1硫酸铜溶液、5ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物，混合液消化变清后再回流3h。
（3）消化液中氮测定消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100ml容量瓶中，至体积大约为70ml；待冷却后缓慢加入10ml 10mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀，以免因局部碱浓度过高而引起NH3的挥发损失，冷却后用去离子水定容至100ml。
溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar5000）测定。
采用40µl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂Ⅰ为4mol L-1 NaOH 溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。
标准工作溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 50µg N ml-1氯化铵标准溶液于100ml容量瓶中，再分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样液。
用去离子水定容至100ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5µg N ml-1系列氯化铵标准工作溶液，同上测定。
其他具体操作参见仪器使用说明。
（4）结果计算土壤微生物生物量氮：B N = E N / k EN式中：E N 为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EN为转换系数，取值0.45（Jenkinson，1988；Brookes等，1985b）。
微生物生物量碳氮:土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC式中：E C为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EC为转换系数，取值0.45其中：E C1=(TOC值-CK)*{浸提液体积+湿土重*含水量/(1+含水量)}/{湿土重/(1+含水量)}=(TOC值-CK)*{浸提液体积*(1+含水量)+湿土重*含水量}/湿土重含水量=水重/干土重E C1为熏蒸或不熏蒸土样中每g干土中的碳含量土壤微生物生物量氮：B N = E N / k EN式中：E N 为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EN为转换系数，取值0.45其中：E N’=FIA值-CK)*{浸提液体积+湿土重*含水量/(1+含水量)}*（定容体积/消化液体积）/{湿土重/(1+含水量)}=(FIA值-CK)*{浸提液体积*(1+含水量)+湿土重*含水量}*（定容体积/消化液体积）/湿土重含水量=水重/干土重E N’熏蒸或不熏蒸土样中每g干土中的氮含量。