土壤微生物量氮的测定方法
土壤微生物体氮测定方法的研究
土壤微生物体氮测定方法的研究土壤微生物是土壤中最主要的有机质分解者和循环者，对土壤的养分循环、有机质分解和抗性病虫害有着重要的影响。
在土壤微生物研究中，氮是一个非常关键的元素。
了解土壤微生物体氮含量能够为农田生产和土壤质量监测提供重要参考数据。
目前，常用的土壤微生物体氮测定方法主要分为直接测定法和间接测定法两大类。
一、直接测定法1.顶空气相色谱法（HS-GC）：该方法通过将土壤样品与乙酸作用，将微生物体内的氮转化为气体态的氨，然后用顶空气相色谱仪测定氨的含量，进而计算出微生物体氮的含量。
该方法操作简单，测定快速，准确性较高，适用于大样品量和多样品同时测定。
2.直接燃烧法：该方法将土壤样品在高温下燃烧，将微生物体内的氮氧化为氮气，用气相色谱仪测定氮气含量，从而计算微生物体氮的含量。
该方法操作简单，测定过程较快，但存在样品氮转化率不高的问题，会对测定结果产生一定的影响。
3.甲醇硫酸加热浸提法：该方法将土壤样品与甲醇硫酸溶液加热浸提，提取土壤中的微生物体，并将微生物体氮硫化成氨，再用气相色谱测定氨的含量，从而计算出微生物体氮的含量。
该方法适用于多样品同时测定，操作简单，准确性较高。
二、间接测定法间接测定法通过测定土壤中的可溶性氮来间接估算微生物体氮的含量。
1.土壤凯氏钠铼溶液（BROOMS的方法）：该方法通过土壤样品与凯氏钠铼溶液反应，测定土壤中可溶性氮的含量，然后通过对微生物体氮和可溶性氮进行回归分析，建立回归模型，从而间接估算微生物体氮的含量。
该方法操作简单，适用范围广，但准确性较低。
2.直接高温燃烧法：该方法将土壤样品在高温下燃烧，将土壤中的氮完全氧化为气态氮，再用气相色谱仪测定氮气含量，从而计算土壤中总氮的含量，再和微生物数量进行回归分析，从而估算微生物体氮的含量。
该方法准确性较高，但操作较为复杂。
综上所述，土壤微生物体氮测定方法主要包括直接测定法和间接测定法。
直接测定法操作简单，测定快速，准确性较高，适用于大样品量和多样品同时测定。
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
土壤可溶性有机氮,硝态氮,铵态氮和微生物量氮测定
土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。
取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。
干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。
按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。
其中熏蒸后的土壤过滤液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。
母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存2.测定可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮）要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方便的。
以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。
土壤可溶性全氮测定氧化剂:将6g NaOH 和30g K2S2O8溶于蒸馏水中并定容至1L(K2S2O8 比较难溶，在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，致其温度达到常温后与K2S2O8溶液混合定容至1L)测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A220和A275，空白需加入1ml氧化剂并同时作水浴处理。
（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。
）标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为100mg/L的氮标准贮存液。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法1．主题内容与适用范围本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。
2．方法提要土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
3．提取液的制备3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜3.2试剂的制备：0.5 M K2SO4溶液（化学纯）、无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积比2:1于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）3.3分析步骤：3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。
如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。
微生物碳氮磷测定
土壤微生物量碳氮磷测定方法一、试剂配制微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。
最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。
10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。
凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定
土壤微生物量氮的测定方法1.试剂配制：(1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、五水硫酸铜10g、硒粉1g。
均匀混合后研细,贮于瓶中。
(2)密度为1.84浓硫酸。
(3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解定容至1L。
(4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。
（按体积比100:2加入混合指示剂）(5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。
(6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定之。
(7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1L。
(8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。
再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。
将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。
2.试验步骤：。
（1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。
取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。
干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。
按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。
土壤微生物量碳氮测定方法
土壤微生物量碳氮测定方法土壤微生物量碳氮测定是评估土壤有机质含量和土壤微生物活性的重要方法之一、它可以帮助我们了解土壤中有机质的分解和氮素的转化过程，对土壤健康和养分循环有重要意义。
下面将从土壤微生物量碳氮的测定原理、方法以及应用等方面进行详细的阐述。
一、原理与意义：土壤微生物量碳（Microbial Biomass Carbon, MBC）是土壤中微生物所含有的碳量，包括微生物本体的碳和微生物产生的胞外有机物的碳。
土壤微生物量氮（Microbial Biomass Nitrogen, MBN）则是土壤微生物所含有的氮量。
土壤微生物量碳氮的测定主要利用的是微生物生物量对有机碳氮的吸收和蓄积能力，在土壤中有机质降解与微生物活动之间存在着紧密的关系。
测定土壤微生物量碳氮的主要意义在于：1.评估土壤质量：土壤微生物是土壤中的重要组成部分，对土壤生态系统的功能发挥起着重要作用。
通过测定土壤微生物量碳氮，可以判断土壤中的微生物含量和活性，进而评估土壤的质量和健康状况。
2.预测土壤肥力：土壤微生物参与了有机质的降解和养分的转化过程，因此它们的代谢活动直接影响土壤肥力。
测定土壤微生物量碳氮可以预测土壤中有机质的分解速率和养分的供应状况，为合理施肥提供依据。
3.监测土壤生态系统的健康：土壤微生物对环境变化非常敏感，其数量和活性的变化可以反映土壤生态系统的稳定性和健康状况。
通过定期测定土壤微生物量碳氮，可以监测土壤生态系统的变化，帮助我们了解土壤的自净能力和恢复能力。
二、测定方法：目前，常用的土壤微生物量碳氮测定方法主要有不同源于Chen et al. (1998) 和Jenkinson及仪器方法（如戴弗尔仪器、百威仪器等）。
1.直接抑制剂法：该方法基于土壤微生物量碳氮含量对微生物生长的抑制作用。
通过向土壤样品中加入抑制剂（如消费抑制剂氟愈刀或氯化丙夫），抑制土壤中微生物的生长，然后测定加入抑制剂后土壤中微生物量碳氮的变化。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定方法微生物量、碳氮测定方法是研究微生物数量和代谢活性的关键手段，可用于土壤、水体和生物体等环境中的微生物研究。
常用的微生物量、碳氮测定方法包括显微镜计数法、流式细胞术、气体产量法、碳氮比测定法等。
下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。
一、显微镜计数法显微镜计数法通过显微镜观察和计数微生物的数量来测定微生物量。
其原理是将样品置于显微镜下，在显微镜下观察样品中的微生物数量，并进行计数。
根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中微生物的数量。
显微镜计数法的操作步骤如下：1.获取样本并制备薄片。
根据需要采集样本，并将样本制备成薄片或涂片。
可以使用高温固定、化学固定或热固定等方法固定样本。
2.显微镜观察和计数。
将固定的样本放入显微镜下，通过放大镜头观察样本中的微生物，并进行计数。
为了避免重复计数和遗漏计数，可以使用方格计数器。
3.根据计数结果计算微生物量。
根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中的微生物数量。
通常计算结果以每克（或每升）样品中的微生物数量表示。
二、流式细胞术流式细胞术是用于计数、分类和分析微生物的一种高通量、高精读的方法。
其原理是将样品中的微生物通过细胞色素或抗原标记，通过流式细胞仪进行激光扫描，扫描到的细胞信号通过计算机进行分析，从而得到微生物的数量、大小和类型等信息。
流式细胞术的操作步骤如下：1.准备样品和染色。
根据需要采集样本，并给样本进行染色。
染色可以使用细胞色素或抗原标记法，将需要测定的微生物区分出来。
2.流式细胞仪扫描。
将染色的样品装入流式细胞仪中，通过激光扫描仪器扫描染色的细胞，并记录扫描到的细胞信号。
3.数据分析。
通过计算机分析扫描到的细胞信号，得到微生物的数量、大小和类型等信息。
三、气体产量法气体产量法是通过测定微生物代谢过程中产生的气体来间接测定微生物的数量和代谢活性。
常用的气体产量法有氧呼吸测定法和甲烷产量测定法。
气体产量法的操作步骤如下：1.准备培养基和反应器。
土壤微生物量氮
茚三酮反应-N法测定微生物量N试剂制备1. 还原水合茚三酮(hydridantin)称取80g茚三酮放入2升90℃热水中, 加入400ml 40℃抗坏血酸(V.C.80g)水溶液, 放置30分钟; 流水冷却1小时至室温, 过滤冲洗, 在闭光真空干燥器中放入P2O5干燥, 可得约75g, 放置于暗色瓶中.2. 乙酸钠缓冲液(pH5.5)每配100ml茚三酮试剂用25ml。
配500ml200ml水中加入27.20g NaOAc.3H2O 放入水浴中使其充分溶解，冷却至室温加入50ml冰醋酸标定至500ml，pH应为5.51±0.03。
该缓冲液在4℃下可保存。
3. 茚三酮试剂每样用1.00 ml，100ml配制方法：2g 水合茚三酮(ninhydrin)和0.3g的还原水合茚三酮溶解于75ml的二甲基亚砜DMSO (DiMethylSulfOxide)和25ml 的乙酸钠缓冲液；然后用无氧氮气通气30分钟，4℃下密闭一天备用。
4. 柠檬酸缓冲液(pH5.0)每样用2.00 ml，250ml配制方法：10.50克柠檬酸和4.00克NaOH加入到225ml 蒸馏水中, 用10M NaOH调整到pH 5.0, 标定至250ml。
保存于4℃。
5. 稀释乙醇：95%加入同体积的蒸馏水。
每样用5.0 ml。
6. 标准液：0，50, 100, 200, 250, 500，1000μM.l-1 N的(NH4)2SO4溶液。
保存于4℃。
准确称取0.0661g 分析纯(NH4)2SO4 (FW=132.1)，定容至1000ml。
50, 100, 200, 250, 500μM.l-1N：分别吸取5ml,10ml, 20ml, 25ml,50ml的1000μM.l-1(NH4)2SO4-N溶液定容至100ml。
操作步骤-准确吸取1.00 ml的浸提液(或标准液)加入20ml试管中；-加入2.00 ml的柠檬酸缓冲液；-慢慢加入1.00 ml茚三酮试剂并充分混匀，放上橡胶塞（注意不要塞紧）；-在沸水中加热25分钟；-冷水浴冷却至室温后加入5. 00ml稀释乙醇，充分混匀，在570nm处比色。
土壤微生物学特征的测定
土壤微生物学特征的测定一土壤微生物量碳、氮的测定将新鲜的土壤样品含水量调节至田间含水量的30%~50%，25℃下密封预培养7~10d,以保持土壤均匀和不同的地方所得结果的可比性。
然后迅速测定土壤微生物量碳氮，或在低温4℃下保存。
采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法测定土壤微生物量碳氮，即称取预处理的湿润土壤每份20.0g（烘干基重）放入50ml烧杯中，将其置于底部有少量NaOH、少量水（约200ml）和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3-5min；然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200ml提取瓶中，加入约80ml0.5mol/LK2SO4提取液（土水比为1∶4），振荡30min后过滤，得土壤提取液每份土样重复3次。
同时做未熏蒸空白和试剂空白。
土壤微生物量碳：用重铬酸钾氧化法测定吸取10ml土壤提取液于150ml消化管中，加入0.2mol/LKCrO和浓硫酸各5.0ml，再加入少量沸石，混匀，于175℃磷酸浴中煮沸10min。
冷却后全部移入150ml三角瓶中，使总体积约80ml，加入2滴邻啡罗啉指示剂，用0.05mol/LfeSO滴定至砖红色。
土壤微生物量碳（Bc）=Ec/Kc，Ec表示未熏蒸与熏蒸对照土壤的浸取有机碳的差值，Kc未转换系数，取值0.38。
土壤微生物量氮：用凯氏定氮法测定取20ml土壤提取液于250ml消化管中，加入0.19mol/LcuSO溶液0.4ml、浓硫酸6.7ml 消化至澄清，冷却后进行定氮。
土壤微生物量氮（Bn）=En/Kn，En为熏蒸与未熏蒸对照土壤矿质态氮的差值，Kn为转换系数，取值0.45。
二土壤酶活性的测定土壤过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法、脲酶活性用靛酚蓝比色法测定。
过氧化氢酶活性以20min后每克土消耗。
0.02mol/L高锰酸钾毫升数表示，脲酶活性一24h后每百克土NH3-N的毫克数表示。
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法土壤微生物生物量是衡量土壤生态系统功能的重要指标之一、测定土壤微生物生物量可以帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进而指导土壤环境修复以及农田生产管理。
氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法，本文将对该方法进行详细介绍。
首先，介绍氯仿熏蒸法的原理。
氯仿是一种广谱杀菌剂，可以破坏土壤中的微生物细胞膜，使微生物失去活性。
在测定土壤微生物生物量时，将土壤样品放置在含有适量氯仿的密闭容器中，通过熏蒸的方式杀灭土壤中的活性微生物。
熏蒸时间通常为24小时。
然后，通过测定氯仿熏蒸前后土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。
其次，介绍氯仿熏蒸法的操作步骤。
首先，将采集到的土壤样品通过筛网筛选除去杂质。
然后，将土壤样品平均分配到已预先称量好的量筒中。
每个量筒中的土壤样品重量应保持一致。
为了保证测定的准确性，通常会设置重复样品。
接下来，在密闭容器的底部放置氟化钾和含有适量氯仿的吸附剂。
然后，将装有土壤样品的量筒设置在容器的顶部，将密闭容器封闭并在室内温度下进行熏蒸。
熏蒸时间通常为24小时。
熏蒸结束后，取出含有氯仿的吸附剂，并将土壤样品离心以去除残余的溶液。
最后，用适量的蒸馏水冲洗残留在土壤样品中的溶解态氮，并测定冲洗液中溶解态氮的浓度。
最后，介绍氯仿熏蒸法的数据分析和结果解释。
首先，通过测定熏蒸前后土壤样品中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。
常用的计算公式为：其中，溶液体积为冲洗液的体积，土壤样品质量即为放置在量筒中土壤样品的质量。
通过计算，可以得出土壤微生物生物量的结果。
根据测定结果，我们能够了解土壤微生物的数量和活性程度。
较高的土壤微生物生物量通常表示土壤中的微生物丰富多样且活跃，土壤生态系统功能较好。
而较低的土壤微生物生物量则提示土壤中微生物数量和活性较低，土壤生态系统功能受到一定程度的抑制。
因此，通过氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量，可以为土壤环境修复和农田生产管理提供科学依据。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)汇总
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量氮的测定方法
土壤微生物量氮的测定方法土壤微生物量氮（Microbial biomass nitrogen，MBN）是土壤中微生物形成的氮的总量，是土壤中活性微生物数量和活力的指标之一、测定土壤微生物量氮的方法有多种，下面介绍其中几种常用的方法。
1.氯仿熏蒸法氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物量氮的方法。
具体操作步骤如下：（1）选取代表性的土壤样品，将土壤样品过筛，并按照一定比例称取一定质量的土壤样品。
（2）将称取的土壤样品放入密封容器中，向容器中加入一定量的氯仿（或氯仿和甲醇混合物），使土壤样品充分与氯仿接触。
（3）密封容器，摇动混匀，使氯仿充分揉搓土壤样品，并让土壤样品中的微生物氮释放。
（4）打开容器，将装有氯仿的倒头管放入容器中吸取氯仿，并尽量不吸取液体底部的土壤悬浮液。
（5）将吸取的氯仿放入创口板上，用水浴加热挥发氯仿，使样品中的微生物氮固定为氨态氮。
（6）再将固定后的氨态氮用氯化亚铜溶液测量，即可得到土壤中的微生物量氮。
2.氯仿氯化亚铜法氯仿氯化亚铜法是一种精确测定土壤微生物量氮的方法。
具体操作步骤如下：（1）取一定质量的土壤样品，经过干燥和过筛处理后，称取一定质量的土壤样品。
（2）将称取的土壤样品与一定体积的氯仿混合，并进行摇动搅拌，使土壤样品充分与氯仿接触。
（3）将搅拌后的土壤样品与一定质量的氯化亚铜溶液混合，使土壤样品中的微生物氮转化为氨态氮。
（4）经过一定时间的反应后，向反应体系中加入一定量的盐酸，破坏悬浮液中未转化的氯化亚铜。
（5）用氯化亚铜溶液测量反应体系中残留的氯化亚铜，即可计算出土壤中的微生物量氮。
3.直接抑制法直接抑制法是一种快速测定土壤微生物量氮的方法，其原理是通过添加抑制剂抑制土壤中的微生物活动，从而间接测定微生物量氮的含量。
目前常用的抑制剂包括三氟乙酸（TFPA）和亚硝酸盐等。
具体操作步骤如下：（1）取一定质量的土壤样品，分为两组。
（2）一组不加抑制剂，作为对照组。
另一组加入一定量的抑制剂，抑制土壤中的微生物活动。
土壤微生物生物量的测定(滴定法)
土壤微生物生物量(碳、氮）的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。
耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。
近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。
目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。
氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。
二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。
方法为：量取500ml氯仿于1000ml 分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。
最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。
MBC+MBN测定-2014.03.27
MBC+MBN 测定（氯仿熏蒸-K 2SO 4浸提法）原理：通过氯仿熏蒸杀死土样中微生物，尸体分解并释放出TOC 。
熏蒸土样测得值减去不熏蒸土样测得值即为MBC/MBN （微生物生物量C ）。
样品熏蒸准备：1. 同一个鲜土样，称取两个（各10 g ），一个做熏蒸，放到50 ml 小烧杯中；一个做不熏蒸，放到离心管中。
2. 熏蒸过程：干燥器底部放置3张普通滤纸，铺开，加去离子水湿润，将烧杯放置于干燥器中。
取烧杯一只，用玻璃珠铺满底部，加入25 ml 左右氯仿，放入干燥器中。
取凡士林均匀涂抹于干燥器与盖子接触的边缘及盖子的塞子，稍微转动盖子使密封性更好。
盖上塞子，使干燥器内外相通，将干燥器与真空泵连接。
打开真空泵抽气至氯仿沸腾并保持2 min ，旋动塞子以密封干燥器，关闭真空泵，将干燥器套上黑色塑料袋两只以隔绝光照，培养24 h 。
将用离心管承装的土样置于另一干燥器中，盖上盖子，同样套上两层黑色塑料袋，培养24 h 。
（注意：氯仿见光会生成毒性气体，其操作应在通风橱中进行）3. 每批熏蒸应至少做两个空白。
4. 浸提：配制0.5 mol/L K 2SO 4溶液（87.1 g K 2SO 4定容至1 L ）熏蒸结束后，将烧杯中的熏蒸土样取出，每个烧杯的土样用40 ml K 2SO 4洗至干净离心管中，用离心管培养的土样则取出直接加40 ml K 2SO 4。
震荡（250频率30分钟）离心（4000转10分钟），过滤，然后用0.45 μm 的滤膜抽滤。
5. 测定：由于MBC 、MBN 浓度较大，所以测定时需要稀释10倍后再进行测定。
MBN 用连续流动分析仪测定，计算用TN-NH4+NO3 即可得出有机氮含量。
土壤微生物生物量碳计算公式为：()EC NF F K C C MBC /-=其中，MBC 为土壤微生物生物量碳含量（mg•kg -1）， CF 为熏蒸样品的有机碳含量，CNF 为不熏蒸样品的有机碳含量，单位均为mg•kg -1；KEC 为微生物碳的浸提系数，为0.38（Joergensen, 1996）。
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。
1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。
2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。
直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。
直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。
现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。
本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。
二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。
二、试剂1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。
将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。
2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。
四、操作步骤称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。
将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。
抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。
熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。
另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。
将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。
土壤微生物量碳氮的测定
土壤微生物量的测定一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）1、试剂配制（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。
方法是量取适量的分析纯氯仿，按1 2（v : v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1mol L-1]（3）硫酸钾浸提剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：取1742.6 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1），溶解24 h。
（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。
注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。
注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。
（6）磷酸溶液（21%）：37ml 85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。
（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。
2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
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ICS13.080.30
B10
团体标准
T/NAIA0001—2020土壤微生物量氮的测定
2020-XX-XX发布2020-XX-XX实施宁夏化学分析测试协会发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》规定编写。
本标准由宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）提出。
本标准由宁夏化学分析测试协会归口。
本标准起草单位：宁夏昊标检测服务研究院（有限公司）、宁夏大学、宁夏农林科学院荒漠所、宁夏化学分析测试协会。
本标准主要起草人：王京、白玲、任亚丽、马晓瑞、刘鸿翔、刘辉、俞鸿千、张小飞、刘娜娜。
本标准于2020年XX月XX日首次发布。
土壤微生物量氮的测定
1范围
本标准规定了土壤微生物量氮的测定方法。
本标准适用于各类土壤微生物量氮的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不住日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 1121.1土壤检测第一部分：土壤样品的采集、处理和贮存
3原理
新鲜土样经氯仿熏蒸24h 后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量氮，用硫酸钾溶液提取微生物量氮，测定提取液中氮含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤氮含量的差值及转换系数，计算土壤微生物量氮。
4试剂和溶液
除非另有说明外，本方法均使用符合国家标准的分析纯试剂，分析用水为GB/T 6682规定的三级水。
4.1氯仿（CHCl 3）。
4.1.1去乙醇氯仿制备
市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前须将乙醇去除。
方法是量取适量的氯仿和二级水按1:2的比例置入分液漏斗中，充分震摇1min 并静置分层后，慢慢放出底层氯仿于干燥的烧杯中，重复洗涤3次，得到无乙醇氯仿，向其中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在4℃、黑暗条件下保存。
注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。
4.2氢氧化钠（NaOH）。
4.3硫酸钾（K 2SO 4）。
4.4硫酸铜（CuSO 4）。
4.5硼酸（H 3BO 3）。
4.6浓硫酸（H 2SO 4）。
4.7甲基红指示剂（C 15H 15N 3O 2）。
4.8溴甲酚绿指示剂（C 21H 14BrO 5S）。
4.9氢氧化钠溶液（1mol/L）
称取40g （精确至0.01g ）氢氧化钠用水溶解，定容至1000mL 。
4.10硫酸钾浸提剂（0.5mol/L）
称取174.26g （精确至0.01g ）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L 塑料桶中，加水2L ，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min ）至完全溶解。
4.11氢氧化钠溶液（400g/L）
称取400g （精确至0.01g ）氢氧化钠加水溶解，定容至1L 。
4.12硼酸溶液（20g/L）
称取20g （精确至0.01g ）硼酸加水溶解，定容至1L 。
4.13硫酸标准溶液（0.02mol/L）
准确移取5.56mL 浓硫酸缓缓注入800mL 水中，用水定容至1000mL ，配制成浓度为0.1mol/L 的硫酸标准溶液，按照GB/T 601对其进行标定。
将此溶液用水稀释5倍得到0.02mol/L 的硫酸标准溶液。
4.14指示剂
称取0.1g（精确至0.0001g ）甲基红和0.5g（精确至0.0001g ）溴甲酚绿指示剂放入玛瑙研钵中，加入100mL 95%乙醇研磨溶解。
5仪器设备
5.1电子天平：感量0.0001g 和0.01g。
5.2真空泵。
5.3恒温培养箱（25℃±1℃）。
5.4凯氏定氮仪。
5.5摇床（25℃，150r/min，300r/min）。
6测量步骤
6.1土壤前处理
新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体(如根、茎和叶)及土壤动物(如蚯蚓等)，过2mm 孔径筛并混匀。
如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。
如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节含水量至田间持水量的40%。
将土壌置于密封的塑料桶内，在25℃±1℃下预培养7-15d。
桶内有适量水以保证相对湿度
为100%，并在桶内放一小烧杯1mol/LNaOH 溶液以吸收土壌呼吸产生的CO 2。
这些过程是
为了消除土壤水分限制对微生物的影响以及植物残体对测定的干扰。
经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，且分析前需在上述条件下至少再培养24h。
6.2熏蒸
称取经前处理相当干50g（精确至0.01g）烘干基的新鲜土壤3份，置于100mL 烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2~3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm 大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯1mol/LNaOH 溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO 2，干燥
器底部还应加入少量水以保持湿度，用真空泵抽真空，在-0.07MPa 真空度下使氯仿剧烈沸腾3~5min。
关闭真空干燥器阀门，于25℃±1℃黑暗条件下熏蒸24h。
打开干燥器阀门时，由于空气进入应该能听见有明显嘶嘶的声音，否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。
取出土壤和氯仿（氯仿倒回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器中，反复抽真空（-0.07Ma）直到土壌无氯仿味为止，否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。
一般需要反复抽真空5~6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。
在熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为对照土壤。
6.3浸提
将熏蒸后的土壤无损转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL 0.5mol/L 硫酸钾浸提剂（4.10），使土水比为1:2（土壤为质量单位g，浸提液为体积单位mL），振荡（25℃，300r/min）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于100mL 塑料瓶中。
另称取等量的3份对照土壤于200mL 聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL 0.5mol/L 硫酸钾浸提剂（4.10）同上浸提。
同时做3个不加土壤的试剂空白，过滤后的浸提液应立即分析，或在-18℃下保存。
6.4消化
取10.0mL 浸提液（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀）于250mL 消化管中，加入0.100g 硫酸铜，5mL 浓硫酸，于电炉上消化，混合液消化变清后再回流3h。
6.5测定
按说明书检查凯氏定氮仪，空蒸15min 洗管道。
消化结束后，冷却，接在蒸馏装置上。
将一三角瓶接在冷凝管的下端，并使冷凝管浸在三角瓶的液面下，三角瓶内盛有25mL 20g/L 硼酸吸收液（4.12）和指示剂（4.14）3滴。
然后向消化管缓缓加入35mL 400g/L 氢氧化钠溶液（4.11），蒸馏5min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的下端（洗入三角瓶中）。
用0.02mol/L 硫酸标准液（4.13）滴定，溶液由蓝色变为酒红色时即为终点。
记下消耗标准硫酸溶液的毫升数。
7结果计算样品中氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（1）计算：
2011001000014.0)(V f m c V V N ⨯⨯⨯⨯⨯-=)
1(⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
式中：
N样品中氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；
滴定样品时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mL）；
V
1
滴定空白时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mL）；
V
C硫酸标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（moL/L）；
0.014氮原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmol）；
M称取试样的质量，单位为克（g）；
F土壤水分系数；
用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL）。
V
2
土壤微生物量氮，按式（2）计算：
=)2(⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
Bc÷
Ec
k
式中：
Bc样品中微生物量氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；
Ec熏蒸土壤浸提测定的氮含量－不熏蒸土壤浸提测定的氮含量，单位为克每千克（g/kg）；
K转换系数，取值0.45。
结果保留三位有效数字。
8精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。