碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨

碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨

An Effective Method to Recover DNA from Agarose gel

<<生物技术>>2004年02期

曹阳, 董晓宇, 姜国斌, 乌兰, 安利佳

采用碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中的DNA,达到分离纯化目的,回收后的DNA可用于重组、PCR等研究.首先将含有目的DNA的琼脂糖凝胶用NaI溶液融解,然后加入CaCl2和NaHCO3,生成CaCO3沉淀,DNA与CaCO3形成复合物,通过离心分离出沉淀复合物,利用稀酸溶解沉淀,再用无水乙醇沉降,即可回收目标DNA.利用该方法回收了质粒、毛白杨和转基因羊基因组DNA,回收率为20％～50％,OD260/OD280为1.7～1.9,最大回收了21kb片段,最小回收250bp片段,回收后的DNA样品进行了PCR扩增和限制性内切酶反应,PCR可以扩增出目的片段,同时限制性内切酶可以将回收后的DNA切开,表明DNA质量良好.利用碳酸钙沉淀法可以回收琼脂糖凝胶中的DNA,此法简单、易行,较为有效.

DNA重组实验中的常用技术

点击次数：29 发表于：2008-06-18 14:53转载请注明来自丁香园

来源：互联网

五、真核细胞基因组的制备

从不同组织细胞或血细胞中提取是进行基因诊断的先决条件。制备的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取的反应体系中，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使分子尽量完整地分离出来。具体方法如下：

（一）白细胞的制备

（1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2 灭菌30min）抗凝。

（2）将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl (pH7.5)、5mmol/L MgCl2 、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。

（3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，STMT重复处理1～3次。

（4）弃上清，白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置37℃水浴15～20h。

（5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm离心5min。

（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醇（24：1）抽提，3000rpm离心5mi n 。

（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1），抽提，3000rpm离心5min。

（8）小心吸取上层水相，加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀，-20℃过夜。（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml 75%乙醇4℃静置1h，离心，1 0000rpm 10min。

（10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。

（11）加200μl 1×TE溶解，置4℃保存。

（12）对所提用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

（13）取2～4μl 样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提的质量及降解情况。

（二）组织的制备

（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris, p H7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。

（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。由于从核中释放出来，样品变得粘稠。（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37℃保温1～3d，直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。

（4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。

（5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段，并移入一新管，吸干中的无水乙醇。

（6）溶于4ml 0.1×SSC中，4℃过夜可作进一步纯化。

（7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。

（8）同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。

（9）75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。适量1×TE溶解，保存在4℃。

六、转移基因

最常用的将克隆重组的片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。转染的可能是通过吞饮作用进入细胞质，然后进行细胞核。

（1）配制下列溶液

①2×HEPES-缓冲盐溶液（HBS）

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌，分装贮存于4℃。

④将（约20μg/106 细胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用浓度为40μg/ml。为使转化效率达到最高，质粒应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用量较少，应加入载体将浓度调至40μg/ml。实验室制备的真核载体转染效率通常要比商品化的牛胸腺、鲑鱼精高。载体用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。

（2）转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞，以1～2×105 细胞/cm2 的密度重新种入60mm组织培养皿中。在37℃、5%～7%CO2 及一定湿度的培养箱中培养20～24h。

（3）每转染一个60mm培养皿中的单层细胞，须依如下方法制备磷酸钙- 共沉淀物：取步骤一所制备的[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中，缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙（温和混合30s左右）。于室温育20～30min，其间将形成细小沉淀。温育结束时，用吸管将混合液吹打一次，使沉淀物悬浮。

通常采用的另一方案是将氯化钙和的稀释混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙（250mmol/L）的。按照前述方法温育之。

如果需要转染更为大量的细胞，上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番，则须使用更大的塑料管，一般在25cm2 细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上，可将0.5ml磷酸钙- 共沉淀物加入5ml培养液中，而在90mm细胞培养皿上，一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。

已经发表的方案中，混合各组分的方式与速率大不相同。其中有一些认为除了温和振摇之外，其它措施均无济于事，并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。其它一些方案则规劝在加入溶液时连续而缓慢地混匀，然后再温和振荡。其目的是为了避免急速形成粗沉淀物，以致降低转化效率。