凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱
GPC分离是基于样品分子的溶剂化体积
GPC 在色谱柱中的分离是基于分子在溶剂表现
出的体积而不是分子量
GPC分离原理
(1) 固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔 径内部
(2) 样品与固定相之间无作用力
(3) 迁样品移时间不同
填充物颗粒
大
中
孔穴
小
GPC分离原理示意图
solution
solvent
浓度检测器
体积大的分子先 被淋洗出来
体积小的分子后 被淋洗出来
GPC是如何工作的
GPC曲线
GPC曲线
浓度响应
W(M)
代代表表了了相分对子分量子的质大量小的--M大；小—M 浓度响应代表了了含含量量—--WW（(MM）)
样品制备的影响
样品浓度与分子量相关（分子量越大，浓度越低） 除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须
过滤 为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动或
1 凝胶色谱的任务
分子量的分布与高分子材料 的所有关键加工特性以及材料 性能紧密相关
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
用GPC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所 测的值：
– Mn：用渗析计测出(Osmometry) – Mw：用光散射计测出(Light Scattering) – Mv：用粘度计测出(Viscometry) – Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) – Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) – Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
凝胶渗透色谱实验报告
凝胶渗透色谱实验报告《凝胶渗透色谱实验报告》实验目的：通过凝胶渗透色谱技术分析样品中的蛋白质组成，了解其分子量分布和纯度。
实验原理：凝胶渗透色谱是一种分离生物大分子的技术，其原理是利用凝胶的孔隙大小对分子进行分离。
大分子在凝胶中的孔隙内滞留时间长，小分子则穿过凝胶孔隙，因此可以实现对分子的分离。
实验步骤：1. 准备样品：将待测样品溶解在适当的缓冲液中，使其浓度适当。
2. 样品加载：将样品加载到色谱柱上，通过压力或离心力使其进入色谱柱内。
3. 色谱分离：在缓冲液的作用下，样品中的蛋白质分子根据其大小在色谱柱中进行分离。
4. 检测分离结果：通过检测器检测样品在色谱柱中的分离情况，得到蛋白质的分子量分布和纯度信息。
实验结果：通过凝胶渗透色谱实验，我们成功地分离出了样品中的蛋白质组成，并得到了它们的分子量分布和纯度信息。
根据实验结果，我们可以进一步了解样品中蛋白质的组成和结构，为后续的研究提供重要的参考数据。
实验结论：凝胶渗透色谱技术是一种有效的生物大分子分离方法，可以用于分析样品中蛋白质的组成和纯度。
通过本次实验，我们成功地应用了该技术，并得到了有意义的实验结果，为后续的研究工作奠定了基础。
总结：凝胶渗透色谱技术是一种重要的分离技术，对于生物大分子的分析具有重要意义。
通过本次实验，我们对该技术有了更深入的了解，并为今后的实验工作提供了宝贵的经验。
通过凝胶渗透色谱实验报告，我们对该技术的原理、步骤、结果和结论有了更清晰的认识，为今后的科研工作提供了重要的参考。
希望通过不断的实验探索和研究，能够更好地应用这一技术，为科学研究做出更大的贡献。
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。
它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。
今天，我们将深入探讨这两种方法之间的区别，以便更好地理解它们的应用和优势。
一、原理1. 凝胶过滤色谱法：凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。
它利用具有特定孔径大小的凝胶填料，大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出，而小分子则能够进入孔隙而被滞留，从而实现分子的分离和纯化。
3. 凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。
它利用凝胶填料形成的三维网络结构，分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比，因此分子越大，其在凝胶中的渗透速度越快，分子越小，渗透速度越慢，从而实现分子的分离和纯化。
二、区别1. 分离原理不同：凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的，而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。
2. 分子范围不同：在凝胶过滤色谱法中，适用于分离分子量较大的物质，而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质，并且对于高分子更为有效。
3. 分离效果不同：凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果，但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。
而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。
三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子，用来检测生物大分子的分子大小和形态。
而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外，还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。
四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。
在实际科研工作中，选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。
我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估，选择合适的色谱方法进行分离和分析。
总结回顾通过本文的讨论，我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。
这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值，能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析，对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
现代材料分析测试技术 凝胶渗透色谱 GPC
• 含有固化剂的EPOXY
酚醛树脂在室温条件下的自然 固化现象观察
8 6 4
RI/mv
2 0 -2 -4 15
1d 2d 5d 11d 19d
20
25 t/min
30
35
补充内容：水相GPC的应用
• 用于溶解于水的聚合物 • 较有机相GPC要复杂得多
水相GPC中存在的问题
• 非体积排除效应
• 分子尺寸不能直接反映分子质量及其分布 的信息。
聚合物分子量的特点
1.分子量大 2.多分散性
3.分子量统计平均值+分布系数才能确切 描述聚合物分子量
GPC分离机理
二、GPC仪器的基本配置
• • • • • • 溶剂贮存器(Solvent) 泵(Pump) 进样系统(Autosample ) 色谱柱(column) 检测器(detector) 数据采集与处理系统(Data Acquirement and Process System) • 废液池 (Waste)
（1）分子质量变化不大
• 这是由于分子链发生了氧化现象，生成了 其它物质，如羟基被氧化为醛、酮或酯的 结构，这时聚合物整体的分子链长度没有 明显的改变，但聚合物的性质发生了变化， 这时可以通过红外的方法检测其分子链结 构组成的变化。
（2）分子质量降低
• 有些高聚物的老化是因为分子链的断裂， 这时分子量急剧下降，使产品性能发生显 著的变化。如纤维强度下降，变脆，达不 到使用要求。
仪器基本配置流程图
3 2.5 2
RI/mv
1.5 1 0.5 0 -0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
泵(515 HPLC Pump)
• 要求精度很高
凝胶渗透色谱法
实验6凝胶渗透色谱法测定聚合物的分子量和分子量分布聚合物分子量具有多分散性，即聚合物的分子量存在分布。
不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。
分子量对聚合物的性能有十分密切的关系，而分子量分布的影响也不可忽视。
当今高分子材料已向高性能化发展，类似分子量分布等高一层次的高分子结构的问题，越来越引起人们的重视。
自高分子材料问世以来，人们不断探索分子量分布的测定方法，直到60年代凝胶渗透色谱诞生，成为迄今为止最有效的分子量分布的测定方法。
一．实验目的1.了解凝胶渗透色谱的原理；2.了解凝胶渗透色谱的仪器构造和凝胶渗透色谱的实验技术；3.测定聚苯乙烯样品的分子量分布。
二．实验原理凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）也称为体积排除色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC）是一种液体（液相）色谱。
和各种类型的色谱一样，GPC/SEC的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物种不同分子量的高分子组份。
当样品中不同分子量的各组份的分子量和含量被确定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。
一般认为，GPC/SEC是根据溶质体积的大小，在色谱中由于体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。
高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。
凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。
当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。
由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动，它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。
凝胶渗透色谱法测高聚物的分子量分布
凝胶渗透色谱法测高聚物的分子量分布聚合物的分子量及分子量分布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物的物理机械性能影响很大。
在聚合物分子量的测定方法中凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography, GPC）由于其快速方便的特点受到了广泛的应用。
一、实验目的1．了解凝胶渗透色谱法测高聚物分子量分布的原理2．熟悉安捷伦型凝胶渗透色谱仪的简单工作原理和操作。
二、GPC简单原理凝胶渗透色谱（Gel Permeation chromarography 简称GPC）为一种液体色谱，是一种很有效的分离技术。
其分离过程在装填有多种固体的“凝胶”小球的谱柱中进行。
凝胶多为高交联度的聚苯乙烯或多孔硅胶。
这些凝胶孔径的大小要与所分离聚合物的分子尺寸相同。
用待测样品的良溶剂不断淋洗色谱柱，当把用相同溶剂制备的试样稀溶液注入柱前淋洗液中后，待高聚物从柱的尾竿流出时，即得分级。
关于GPC的分离机理，目前尚无一完备的理论，但就目前存在的理论可以分为三大类：平衡排除理论；限制扩散理论；流动分离理论。
其中最常用的，认为起主要作用的是平衡排除理论；流速较低时扩散在分离过程中是不重要的；至于液动分离机理则只在液速很高时才起作用。
按照此理论，GPC是基于大分子尺寸不同而进行分级的。
凝胶孔洞的大小有一定的分布，当溶解的聚合物分子液以多孔小球时，扩散到凝胶孔结构内去的程度依赖于分子的尺寸和凝胶孔径的大小和分布。
尺寸大的分子只能进入凝胶内层的一小部分，或完全被排除在外；而尺寸小的分子则能渗透到大部分的凝胶内层中去，因此分子的尺寸越大，在柱中走的路程越短，相反，分子的尺寸越小，在柱中的路程越长，保留时间也就越长。
这样，当高聚物流经色谱柱时，就按其分子量的大小分开，大分子首先流出，达到分级的目的。
分离过程如图1。
图1 GPC 的分离原理柱子的总体积可分为三部分：凝胶粒间体积V 0，凝胶骨架体积V GM ，凝胶总孔洞体积V i ；如果柱子的总体积为V t则： V t ＝V 0＋V i ＋V GM （1）如果某种尺寸的大分子可进入的孔洞体积为V i acc ，则其淋出体积V c 应为：我们定义分配系数为：i i d V acc V /K ⋅= （2） i d c V K V V +=0 （3）如果K d ＝1，则该分子可进入全部孔洞，此时V c ＝V 0＋V i ；如果K d ＝0则该分子完全被排斥在孔洞之外，此时V ＝V 0。
凝胶渗透色谱(GPC)
凝胶渗透色谱（GPC）1. 简介凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）是一种常用的分离和分析高分子化合物的方法。
该技术基于样品中高分子与凝胶基质之间的相互作用特性进行分离，并通过检测其分子量进行定性和定量分析。
2. 原理GPC的原理基于高分子在溶剂中形成的动态螺旋结构。
在这个多孔的凝胶基质中，高分子可以通过不同的速度渗透进入孔隙中，较大分子量的高分子会更难进入孔隙，而较小分子量的高分子则相对容易进入。
因此，在GPC中，高分子化合物会根据其分子量的大小在凝胶柱中得到分离，从而实现对样品的分析。
3. 实验操作3.1 样品制备：将待分析的高分子化合物溶解在合适的溶剂中，得到样品溶液。
确保样品溶液中没有明显的悬浮物或杂质。
3.2 柱装填：将凝胶柱装入色谱柱座，并根据柱座的要求进行调整和固定。
3.3 校准：使用一系列已知分子量的标准品进行校准。
将标准品溶液以一定流速注入凝胶柱中，记录各标准品的保留时间。
3.4 样品进样：使用自动进样器或手动进样器将样品溶液以适当流速注入凝胶柱中。
3.5 分离：样品在凝胶柱中进行凝胶渗透分离，不同分子量的高分子以不同的速度通过凝胶基质，完成分离。
3.6 检测：通过不同的检测器检测凝胶柱中流出的样品，常用的检测器包括紫外-可见光谱检测器、折光率检测器等。
3.7 数据处理：根据标准品的保留时间和已知分子量，结合样品的保留时间，计算出样品的分子量。
4. 应用领域GPC广泛应用于高分子化合物的分析和研究领域。
主要应用包括但不限于以下几个方面：•分析聚合物的分子量分布：通过GPC可以获得聚合物样品的分子量分布情况，了解样品中分子量大小的范围和占比，有助于进一步研究和应用。
•聚合物纯度分析：GPC可以用于判断聚合物样品的纯度，通过检测样品中的低分子量杂质，评估样品的纯净度。
•聚合物杂质分析：GPC可以用于分析聚合物样品中的杂质物质，如副产物、残留单体等。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
聚合物的分离与提纯
聚合物的分离与提纯聚合物是由许多重复单元组成的长链分子，具有广泛的应用领域，如塑料、纤维、涂料、药物等。
在许多应用中，需要对聚合物进行分离与提纯，以获得高纯度的产品。
本文将介绍几种常见的聚合物分离与提纯方法。
一、凝胶渗透色谱法（GPC）凝胶渗透色谱法是一种基于分子尺寸的分离方法，适用于高分子聚合物的分子量测定和分子量分布分析。
该方法利用尺寸排除效应，通过样品分子在固定相中的渗透行为进行分离。
较小的分子能够进入凝胶孔隙中，因此在柱上停留时间较长；而较大的分子则无法进入孔隙，因此在柱上停留时间较短。
通过测量样品在不同停留时间下的吸光度或折射率，可以得到分子量分布曲线。
二、溶剂沉淀法溶剂沉淀法是一种常用的聚合物分离与提纯方法。
该方法基于聚合物与溶剂之间的亲疏水性差异，通过调整溶剂的种类和浓度，使聚合物发生沉淀，从而与其他杂质分离。
一般来说，选择一个与聚合物亲疏水性相反的溶剂，将混合溶液加热搅拌，使聚合物溶解，然后冷却至溶剂沉淀温度，聚合物便会从溶液中沉淀出来。
通过离心或过滤，可以分离出聚合物沉淀物。
三、逆向萃取法逆向萃取法是一种常用的聚合物分离与提纯方法，尤其适用于聚合物与溶剂之间亲疏水性相似的情况。
该方法利用添加亲疏水性相反的萃取剂，将目标聚合物从混合体系中分离出来。
一般来说，选择一个与目标聚合物亲疏水性相反的溶剂作为萃取剂，将混合溶液与萃取剂进行充分混合，然后静置一段时间，使聚合物分配到萃取剂相中。
通过离心或分液漏斗分离上下层液体，可以将聚合物与萃取剂分离。
四、超滤法超滤法是一种利用过滤膜对聚合物进行分离的方法。
该方法基于聚合物与其他物质在尺寸上的差异，通过调整过滤膜的孔径大小，使聚合物通过过滤膜，而较大的物质被截留在膜上。
超滤法可以有效去除溶液中的大分子杂质，如胶体颗粒、聚合物凝聚体等，从而提高聚合物的纯度。
总结起来，聚合物的分离与提纯是一项关键的工艺过程，可通过凝胶渗透色谱法、溶剂沉淀法、逆向萃取法和超滤法等方法实现。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
第5章 凝胶渗透色谱
•
死Hale Waihona Puke 间•调整保留时间 与固定液用量有
关
• 比保留体积 相对保留值 保留指数
• 色谱过程方程: VR=VM+VR’
•
VR=VM+KVS
•
色谱的保留值与热力学系数联系起来
• 色谱流出曲线方程：——研究色谱峰形
•
塔板理论：高斯分布曲线
•
c 标准偏差：
nc0
2 tR
exp
1 2
n 1
t tR
2
3.2分离机理简介
• 在现在，虽然GPC已经得到了广泛的应用， 但是就连基本的分理机理都处在百花争鸣 的阶段。目前模型机理可分为4大类：
3.2.1平衡排除理论
• 依据色谱方程，认为分离处于平衡时，即溶质在 胶体孔洞内的停滞时间大于它扩散入与扩散出孔 洞所需的时间，分离的过程就既不受扩散控制也 不受扩散影响。
tR / n
c
c0
2
exp
t tR
2 2
2
• 描述色谱峰大小的参数：
•
峰高h h c0
2
• 峰宽Ｗ W 4
• 分离度：描述峰分离情况
R
2
tR2 W1
tR1 W2
•
分离因素：保留值 峰窄
•
• 色谱定性分析－－依据保留值
• 与已知组分的保留值相比
• 与其它分析方法连用 如ＩＲ
• 第5章 凝胶渗透色谱法
•
• 色谱原理 • 流动相:载气 • 固定相:固体吸附剂等
•
图 气相色谱对样品分离过程示意图
• 色谱谱图解析
• 一 谱图表示方法: 横坐标 时间
•
纵坐标 检测器响应信号的大小 色谱图
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物分子质量和其散布
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子质量及其散布一、实验目的1.了解凝胶渗透色谱法测定聚合物相对分子质量及其散布的原理。
2.了解凝胶渗透色谱仪的仪器构造和初步把握凝胶渗透色谱仪的实验技术。
3．测定聚苯乙烯样品的相对分子质量及其散布。
二、实验原理聚合物的相对分子质量量及其散布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物材料的物理机械性能和可加工性等阻碍专门大。
测定聚合物的相对分子质量及其散布的最经常使用、快速和有效的方式是凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，简称GPC）。
1. GPC分离机理GPC是一种新型液相色谱，除能用于测定聚合物的相对分子质量及其散布外，还普遍用于研究聚合物的支化度、共聚物的组成散布及高分子材料中微量添加剂的分析等方面。
同各类类型的色谱一样，GPC具有分离功能，其分离机理比较复杂，目前还未取得一致的意见。
但在GPC的一样实验条件下，体积排除分离机理被以为起要紧作用。
体积排除分离机理的理论以为：GPC的分离主若是由于大小不同的溶质分子在多孔性填料中能够渗透的空间体积不同而形成的。
装填在色谱柱中的多孔性填料（凝胶）的表面和内部散布着大小不同的孔洞和通道。
当被测试的多分散性试样随淋洗溶剂进入色谱柱后，溶质分子即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度取决于溶质分子体积的大小。
体积较大的分子只能进入较大的孔洞，而体积较小的分子除能进入较大的孔洞外还能进入较小的孔洞，因此体积不同的分子在流过色谱柱时实际通过的路程是不同的，分子体积越大，路程越短。
随着溶剂淋洗进程的进行，体积最大的分子最先被淋洗出来，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被淋洗出来，从而达到使不同大小的分子取得分离的目的。
以上为GPC机理的一样说明。
依照一样的色谱理论，试样分子的保留体积V R（或淋出体积V e）可用下式表示：V e=V o+KV i式中，V e为淋出体积，即指溶液试样从进色谱柱到被淋洗出来的淋出液整体积；V o为柱中填料粒子的粒间体积；V i为柱中填料粒子内部的孔洞体积；K为分派系数，即能够被溶质分子进入的粒子孔体积与粒子的总孔体积之比。
第5章__凝胶渗透色谱
实验部分
溶剂的选择：
能溶解多种聚合物 不能腐蚀仪器部件 与检测器相匹配
实验部分
• 色谱柱对于多分散聚合物的分离作用是基 于体积排除机理，与分子量没有直接联系。 • 把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到 浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋 出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲 线和整个试样的各种平均分子量。
实验部分
影响因素：
色谱柱、溶剂的选择
色谱柱：
每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和 渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使 用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大 的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔 径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不 同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶 孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命。 色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链 比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不 同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定 相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子 质量范围相配的色谱柱。
• 色谱过程方程: VR=VM+VR’ • VR=VM+KVS • 色谱的保留值与热力学系数联系起来 • 色谱流出曲线方程：——研究色谱峰形 • 塔板理论：高斯分布曲线 2 n c 1 t 0 c e x p n 1 2 tR 2 tR • 标准偏差：
实验部分
GPC仪的组成： 泵系统、（自动）进样系统、凝胶 色谱柱、检测系统和数据采集与处 理系统。
泵系统：
包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和 一个高压泵。它的工作是使流动相（溶 剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工 作状况好坏直接影响着最终数据的准确 性。越是精密的仪器，要求泵的工作状 态越稳定。要求流量的误差应该低于 0.01mL/min。
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。
因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。
高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。
本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。
二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。
2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。
3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。
4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。
5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。
1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。
2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。
3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。
在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。
4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。
5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。
通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。
三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱法是基于凝胶粒子之间的高分子链结构，当一种抗原物质经过凝胶时，抗原就会向凝胶中扩散并达到一定的程度。
然后再在一定波长下测定吸光度，即可求出待测抗原的含量。
此法可以测定抗原或抗体的含量，也可用来检测标本中微量、痕量物质的含量及定性、定量地确定样品中待测组分的存在。
此外，此法还可用于确定组织切片中某些非特异性抗原成分的存在。
利用凝胶色谱技术，可以对抗原进行定量，且方法简便，应用广泛。
凝胶渗透色谱法与其他化学分析技术相比，有许多优点：可对蛋白质、抗原等大分子进行定量分析；定量限可以达到1ng/mL。
此外，抗原在凝胶中扩散比较均匀，组分容易分离，定量误差小。
此外，由于组分在凝胶内部扩散较均匀，因此不会发生污染，具有环境友好型。
另外，凝胶还可以用于自动化分析。
利用此法可以快速、准确地测定蛋白质的含量。
凝胶渗透色谱法最初是由Sybaski提出的。
随着凝胶渗透色谱法的不断改进，其应用越来越广泛。
我们在实验室常使用的有硝酸纤维素膜，苯酚一甲醛交联膜和硝酸纤维素渗透泵。
硝酸纤维素膜和苯酚-甲醛交联膜可在短时间内完成制备，而且能同时进行多个样品的测试，它们的最佳工作温度为25。
左右，但长期保存会影响其物理和化学性质。
因此必须注意防潮。
3。
硝酸纤维素渗透泵。
它的工作原理类似于凝胶渗透色谱法，由渗透泵和流动相泵两部分组成。
凝胶通过泵的推动力流入渗透泵内，被泵出后渗入溶液中。
由于受到细菌或真菌等细微颗粒的阻碍，向前推进的阻力越来越大，最终造成流速变慢甚至停止。
因此每个渗透泵都配有自动控制装置，在达到饱和时，机器会自动停止工作。
利用这一特性，可以将待测组分转移至载玻片上，避免样品污染。
在凝胶渗透色谱的研究和应用中，人们还根据某些特殊目的，采用多种多孔膜作为固定相。
这类固定相的应用效果很好，它可以降低系统的渗透压和保持高灵敏度，但也给测定带来一定的困难，主要表现为：（ 1）用有机溶剂处理得到的凝胶因存在机械稳定性问题而不能用于薄层色谱。
第5章凝胶渗透色谱
色谱柱：
GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心 细管中加入孔径不同的微粒作为填料。
填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的 要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶 （适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯 凝胶（最高100℃，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂） 多孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔 氧化铝（适用于水和有机溶剂） 柱子：玻璃、不锈钢
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度 很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多， 都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯 乙烯凝胶）。然而无论哪一种填料，他们都 有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多 按一定分布的大小不同的孔洞。
第5章凝胶渗透色谱
• 尺寸不同的高聚物分子，按其分子大小能自由 地渗透进和渗透出这些凝胶孔洞。
• 凝胶孔洞与分子尺寸是相适应的，超过这个尺 寸的大分子就不能渗透进去，它们只能随溶剂的 流动而在凝胶粒子之间的空间中流动。因此，大 分子比起小分子来说，在柱中的行程就短得多。
• 根据大小分子不同的行程就可以把混在一起的 高聚物分子逐级分离开来，先分离出来的是大分 子，较小的聚合物分子受到溶剂分子的排斥也随 后分离出来，然后再用一定的方法检知每级中溶 质的浓度和分子量。
• 色谱定性分析－－依据保留值
• 与已知组分的保留值相比
• 与其它分析方法连用 如ＩＲ
• 色谱定量分析——峰高或峰面积判断分析
物
的含量
• 色谱优缺点：
• 高效快速分离技术
• 难以鉴别分离组分
第5章凝胶渗透色谱
1.GPC的基本机理
凝胶渗透色谱是一种液相色谱，原理是利 用高分子溶液通过一根装填有凝胶的柱子， 在柱中按分子大小进行分离。
凝胶色谱渗透法
凝胶色谱渗透法凝胶色谱渗透法是一种分离分子的技术。
一些虽然不够有名，但可用于组分分离的新兴科技正在逐渐涌现。
凝胶色谱渗透法可以将分子根据它们在凝胶孔隙中透过能力的不同来分离。
凝胶色谱渗透法是研究生物大分子的常用方法之一。
这种方法可将生物大分子按形态（大小），不同的物理化学特性，分子结构或其他参数对它们进行分离。
一些类型的凝胶色谱渗透法以分离高分子化合物为主，比如胶束渗透色谱法，但是，这种技术同样可用于分离，海绵和膜配体等其他类型的大分子化合物。
凝胶色谱渗透法是以凝胶为基础的分离操作。
凝胶是指一类化合物或成分，它们经过处理可以形成大分子网状结构。
其中，最著名的凝胶把玩具渗透剂水晶土就是其中的一种。
凝胶可形成孔隙或网状结构，针对不同的化合物，可选择不同孔径的凝胶网格进行分离。
要想在凝胶中分离某种物质，首先必须在凝胶分子之间的孔隙中发现绝对匹配该物质孔径的空洞。
其次，可以在空洞内放置要分离的物质，做出分离操作。
对于生物大分子的分离，通常使用的凝胶被称为聚丙烯酰胺凝胶，其特点是具有均匀的孔隙大小和完美的球形结构。
一个生物大分子的化学结构和质量等参数均可以用凝胶色谱渗透法分离出来。
这种方法可以用来分离蛋白质，病毒，抗体等链状生物大分子。
此外，此技术也是一个非常好的测定生物大分子分子质量的手段。
任何渗透技术的基本物理原理都是取决于分子大小。
凝胶色谱渗透法充分利用了这一较为简单的原理，将它融入实验操作中。
如果一件物品在大约200-300个分子的大小或小于分子活性中心时，分子链可以被弯曲起来，导致渗透性增强。
但是只会在一个特定的固定分子大小后再次导致渗透性减少。
凝胶色谱渗透法中的一个重要参数是液相。
液相是渗透分离过程中液体的组成。
现在常用的液相是0.1%维罗紫薯兰素，0.15M盐和0.01M磷酸缓冲液中的混合物。
在液相中加入适当的盐，可以使部分生物大分子形成胶束，以此进一步提高它们在凝胶孔隙中的渗透性。
凝胶色谱渗透法与其他分子分离方法相比还有一个优势。
安捷伦凝胶渗透色谱
安捷伦凝胶渗透色谱安捷伦凝胶渗透色谱（GPC）是一种用于分离和表征高分子化合物的方法，如聚合物、蛋白质、多糖等。
以下是关于安捷伦凝胶渗透色谱的详细说明：1. 仪器组成：安捷伦凝胶渗透色谱系统由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据采集系统和计算机等组成。
2. 工作原理：凝胶渗透色谱的原理是基于分子大小不同，通过多孔凝胶固定相的孔径大小，按分子大小依次分离样品中的各个组分。
在分离过程中，大分子物质先被洗脱，小分子物质后被洗脱。
3. 实验操作流程：凝胶渗透色谱实验的一般流程包括以下步骤：样品准备：将待分析的样品进行适当处理，以便于后续的色谱分离。
流动相准备：选择合适的流动相，一般使用THF、DMF、水相、氯仿、三氯苯等作为流动相。
样品进样：将样品通过进样器注入色谱柱。
洗脱分离：使用高压输液泵将流动相通过色谱柱，按分子大小顺序分离样品中的各个组分。
检测和记录：使用检测器检测各个组分的信号，并通过数据采集系统记录数据。
结果处理：通过计算机处理数据，得到各个组分的分子量分布和浓度等信息。
4. 应用范围：安捷伦凝胶渗透色谱广泛应用于高分子化合物的分析，如聚合物、蛋白质、多糖等。
其应用范围包括高分子聚合物分子量的测定、线性高分子化合物多分散指数的测定、聚合物稳定性的评价及降解过程分析、高分子材料产品质量控制等方面。
5. 注意事项：在进行凝胶渗透色谱实验时，需要注意以下几点：样品准备要适当，以利于后续的色谱分离。
流动相的选择要合适，根据不同的样品选择不同的流动相。
实验过程中要保持严格的温度和流速控制，以保证实验结果的准确性。
对于某些样品，可能需要使用不同的色谱柱或流动相来达到最佳的分离效果。
安捷伦凝胶渗透色谱是一种非常有效的分析高分子化合物的方法，可以提供关于样品分子量分布、分子大小等信息，帮助研究人员深入了解样品的性质和组成。
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实验6
凝胶渗透色谱法
测定聚合物的分子量和分子量分布
聚合物分子量具有多分散性，即聚合物的分子量存在分布。
不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。
分子量对聚合物的性能有十分密切的关系，而分子量分布的影响也不可忽视。
当今高分子材料已向高性能化发展，类似分子量分布等高一层次的高分子结构的问题，越来越引起人们的重视。
自高分子材料问世以来，人们不断探索分子量分布的测定方法，直到60年代凝胶渗透色谱诞生，成为迄今为止最有效的分子量分布的测定方法。
一．实验目的
1.了解凝胶渗透色谱的原理；
2.了解凝胶渗透色谱的仪器构造和凝胶渗透色谱的实验技术；
3.测定聚苯乙烯样品的分子量分布。
二．实验原理
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）也称为体积排除色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC）是一种液体（液相）色谱。
和各种类型的色谱一样，GPC/SEC的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物种不同分子量的高分子组份。
当样品中不同分子量的各组份的分子量和含量被确定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。
一般认为，GPC/SEC是根据溶质体积的大小，在色谱中由于体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。
高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。
凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、
葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。
当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。
由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动，它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。
反之，高分子体积增大，淋洗体积减小，因而达到依高分子体积进行分离的目的。
基于这种分离机理，GPC/SEC 的淋洗体积是有极限的。
当高分子体积增大到已完全不能向微孔渗透，淋洗体积趋于最小值，为固定相微球在色谱中的粒间体积。
反之，当高分子体积减小到对微孔的渗透几率达到最大时，淋洗体积趋于最大值，为固定相微孔的总体积与粒间体积之和，因此只有高分子的体积居于两者之间，色谱才会有良好的分离作用。
对一般色谱分辨率和分离效率的评定指标，在凝胶色谱中也沿用。
图16－1是GPC/SEC 的构造示意图，淋洗液通过输液泵成为流速恒定的流动相，进入紧密装填多孔性微球的色谱柱，中间经过一个可将样品送往体系的进样装置。
聚合物样品进样后，淋洗液带动溶液样品进入色谱柱并开始分离，随着淋洗液的不断洗提，被分离的高分子组份陆续从色谱柱中淋出。
浓度检测器不断检测淋洗液中高分子组份的浓度响应，数据被记录最后得到一张完整的GPC/SEC 淋洗曲线。
如图16－2。
图16－1 GPC/SEC 的构造
淋洗曲线表示GPC/SEC 对聚合物样品依高分子体积进行分离的结果，并不是分子量分布曲线。
实验证明淋洗体积和聚合物分子量有如下关系：
e BV A M −=ln 或 e V B A M log ''log −= （16－1）
式中M 为高分子组分的分子量，A 、B （或A’、B’）与高分子链结构、支化以及溶剂温度等影响高分子在溶液中的体积的因素有关，也与色谱的固定相、体积和操作条件等仪器因素有关，因此（1）式称为GPC/SEC 的标定（校正）关系。
（1）式的适用性还限制在色谱固定相渗透极限以内，也就是说分子量过高或太低都会使标定关系偏离线
性。
一般需要用一组已知分子量的窄分布的聚合物标准样品（标样）对仪器进行标定，得到在指定实验条件，适用于结构和标样相同的聚合物的标定关系。
图16－2 GPC/SEC淋洗曲线和“切割法”示意图
三．仪器和试剂
1．组合式GPC/SEC仪（美国Waters公司），电子天平，13mm微孔过滤器；配样瓶，注射针筒等。
2．四氢呋喃（AR）（淋洗液）；悬浮聚合的聚苯乙烯（被测样品）；窄分子量分布的聚苯乙烯（标准样品）；
四．准备工作
1. 样品配制
选取十个不同分子量的标样，按分子量顺序1、3、5、7、9和2、4、6、8、10分为两组，每组标样分别称取约2mg混在一个配样瓶中，用针筒注入约2ml溶剂，溶解后用装有0.45微米孔径的微孔滤膜的过滤器过滤。
在配样瓶中称取约4mg被测样品，注入约2ml溶剂，溶解后过滤。
2. GPC/SEC的标定
待仪器基线稳定后，用进样针筒先后将两个混合标样进样，进样量为100微升，等待色谱淋洗，最后得到完整的淋洗曲线。
从两张淋洗曲线确定共十个标样的淋洗体积。
作logM- V e 图得GPC/SEC 标定关系。
五．实验步骤：
1.仪器观摩
了解GPC/SEC 仪各组成部分的作用和大致结构，了解实验操作要点。
设定淋洗液流速为1.0ml/min 、柱温和检测温度为30℃。
了解数据处理系统的工作过程，但本实验将数据处理系统仅用作记录仪，数据处理由人工完成，以便加深对分子量分布的概念和GPC/SEC 的认识。
2. 样品测定
将样品溶液进样，得到淋洗曲线后，确定基线，用“切割法”进行数据处理，切割块数应在20以上。
六．数据处理：
GPC/SEC 的数据处理，一般采用“切割法”。
在谱图中确定基线后，基线和淋洗曲线所包围的面积是被分离后的整个聚合物，以横坐标对这块面积等距离切割。
切割的含义是把聚合物样品看成由若干个具有不同淋洗体积的高分子组份所组成，每个切割块的归一化面积（面积分数）是高分子组份的含量，切割块的淋洗体积通过标定关系可确定组份的分子量，所有切割块的归一化面积和相应的分子量列表或作图，得到完整的聚合物样品的分子量分布结果。
因为切割是等距离的，所以用切割块的归一化高度就可以表示组份的含量。
切割密度会影响结果的精度，当然越高越好，但是一般认为，一个聚合物样品切割成20块以上，对分子量分布描述的误差已经小于GPC/SEC 方法本身的误差。
当用计算机记录、处理数据时，可设定切割成近百块。
用分子量分布数据，很容易计算各种平均分子量，如n M 和w M 。
∑∑∑===i i i i i n i i i n M H H M W M 11 （16－2）
∑∑∑===i i
i i
i i
n i i w H M H M W M 1 （16－3）
式中，H i 是切割块的高度。
根据（2）、（3）式计算出样品的数均和重均分子量，并计算多分散系数d 。
七．回答问题及讨论
1．高分子的链结构、溶剂和温度为什么会影响凝胶色谱的校正关系？
2．为什么在凝胶渗透色谱实验中，样品溶液的浓度不必准确配制？。