双光子荧光

新型双光子荧光染料DMAHAS在人-鼠肝癌模型中的应用

ｃｌｎｔｐｌｃｔｏｏｒｃｉｇｔｅｔｍｏｅｌｉｃｅｒｎｕｍａｐＧ２ｃｌｓｅｌａｄｉｓａｐｉａｉｎｆｒｔａｋｎｈｕｒｃｌｎｍｉｅｂａｇｈｓｉｎＨｅｅｌ．Ｔｈｎｖｔｏｃｔｔｘｃｔｅｉｉｒｙｏｏｉｉｙ
中图分类号：７５３Ｒ３．文献标识码：Ａ文章编号：０６１０（０００－３６０１０ —７３２１）６０８－４
ＡｐｉａｉｎｏｖｌＴｗｏｐｔｎＡｂｏｂｎｇＦｌｒｓｅｅｉｐｌｔｏｆａＮｏｅｃ－ｈｏｏｓｒｉｕｏｅｃｎｃｎＨｕｍａｐｔｃＣａｅｉｓＸｅｏｒｆｉｅＭｏｅｎＨｅａｉｎｃｒＣｅｌｎｇａｔＭｃｄｌ
Ｄｉ— ｎＢＩｅｇｌｎ，ＺＡＧＪｇｐｎ，Ｈｈｎ－ｎＵＸｕｍｉ，Ａｎ —ａｇＨＮｉ —ｉｇＵＣｅｇｉＺｉｎｊ
（ａｏａｒＭｄｃｅＪａｌａｙＨｏｐｔ，ｉａ，５０１Ｌｂｒｔｙｅｉｎ，ｉｎＭｉｔｓｉｌＪｎ２０３）ｏｉｎｉｒａｎ
性分析采用ＭＴ、Ｙ中性红（Ｒ）考马斯亮蓝（Ｂ和流式细胞术（Ｃ等方法。ＤＨＳＮ、ｃ）ＦＭ）ＭＡＡ标记肿瘤细胞的体内示踪在人
肝癌模型中进行，切除的肿瘤异种移植物经荧光成像和传统的组织病理分析。此外，我们建立了一种基于ＤＨＳ释放ＭＡＡ的细胞毒性分析方法。研究结果表明ＤＨＳＨｅＧＭＡＡ对ｐ２细胞无明显毒性，它显示出对活细胞很高的穿透性和稳定的细胞质定位。体内细胞示踪实验表明它是一种用于肿瘤示踪和荧光成像的可靠探针。关键词：细胞毒性；双光子吸收；荧光成像；细胞毒Ｔ细胞；肝癌

荧光材料的双光子效应

荧光材料的双光子效应
荧光材料的双光子效应是指当一束激光通过荧光材料时，两个光子同时被吸收并导致荧光发射的现象。

这种效应在近年来得到了越来越多的关注，因为它具有许多优点，例如更高的空间分辨率和深度穿透能力。

荧光材料是一种特殊的材料，它可以吸收一定波长范围内的电磁辐射并发出可见光。

这种现象被称为荧光效应。

在双光子效应中，两个激光光子被吸收后，电子从基态跃迁到激发态，并在退激发过程中发出荧光信号。

与传统单光子激发相比，双光子激发具有更高的局部化和深度穿透能力。

这是因为双光子效应只会在聚焦点处发生，而且其穿透深度比单光子更大。

这使得双光子显微镜成为生物医学领域中重要的成像技术之一。

除了生物医学领域外，双光子效应还可以应用于光电转换、光学存储和激光打印等领域。

此外，由于双光子效应的独特性质，它还可以用于制备具有高分子量的荧光材料。

总之，荧光材料的双光子效应是一种非常有前途的技术，在各个领域
都有广泛的应用前景。

随着技术的不断发展和完善，相信这种技术将会在更多领域得到应用。

双光子荧光概述.

图2a 双光子吸收图2b 单光子吸收 S 单重态能级 T 三重态能级 V 虚拟中间态 hv 吸收光能量 Fl 荧光 Ph 磷光 Ⅺ 系间窜越
一个虚能态 , 通过两个光子的
能量进行叠加而使处于基态的电子达到激发态。
Has not been difficult, then does not have attains
Has not been difficult, then does not have attains
荧光物质在吸收了与其能级结构匹配的能量后，电子由基态
S0 被激发至激发态 S1 ，经过辐
射跃迁后电子又回到基态 S0 ，这一过程中发射出荧光。与单光子荧光不同，双光子吸收过程中，基态与激发态之间存在
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
Has not been difficult, then does not have attains
1 双光子荧光背景介绍
双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。早在1931年, Gppert Mayer 就在理论上预言了双光
双光子荧光产生原理：荧光分子吸收第一个光子后，跃迁到虚能级上，该能级仅能存在几飞秒，便自动返回基态，第二个光子必须在这几飞秒内与虚能级上的分子作用，从基态跃迁到激发态，能量较大的激发态分子,通过内转换
使自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于此能级
的分子不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同的振动能级时，就发射荧光。
子吸收的存在。
直到上世纪60年代初激光器出现后,才由Kaiser等首先从实验上证实了双光子吸收过程。然而,由于一般材料的双光子吸收截面很小,双光子吸收的实际应用受到限制, 使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。

双光子荧光显微成像由于兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具.用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针,是实现成像的关键.双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展,促进生命科学、医学科学的快速发展,同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。

新型光学成像技术——双光子荧光显微镜

新型光学成像技术——双光子荧光显微镜光学成像技术一直以来都是生物学研究的重要手段。

传统的荧光显微镜通过荧光标记物的发光来研究生物分子和细胞的功能，但由于深度限制和荧光标记对细胞和生物体的影响，限制了研究深度和准确程度。

然而双光子荧光显微镜的出现改变了这个现状，具备高分辨率、深度成像和非侵入性标记等特点。

一、双光子荧光显微镜的原理双光子荧光显微镜的成像原理是利用非线性荧光效应——双光子激发荧光效应，当两个光子的能量合成能够与荧光分子的跃迁能量匹配时，荧光分子受到激发，发生荧光发射。

与传统的单光子激发荧光不同，双光子激发荧光只在聚焦点产生明显的荧光信号。

这是因为在双光子激发荧光中，荧光产生需要两个光子的同步作用。

这种非线性过程不利于在样品各个层次产生荧光信号。

因此，在使用双光子荧光显微镜进行样品成像时，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，从而能够获得更高的分辨率和更深的成像深度。

二、双光子荧光显微镜的特点1. 非侵入性成像传统的荧光显微镜需要生物体或细胞中荧光标记物的标记才能进行成像。

而双光子荧光显微镜不需要使用任何外部标记物，可以直接在生物体中进行成像。

这种非侵入式成像能力使得双光子荧光显微镜在活体成像和组织工程等应用方面有着广阔的应用前景。

2. 高分辨率成像由于双光子荧光显微镜的成像原理，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，能够获得更高的分辨率。

深度成像时，同样具备更高的分辨率，在成像深度达到300μm时，其分辨率保持在数百奈米量级。

3. 深度成像双光子荧光显微镜能够获得更深的成像深度。

传统的荧光显微镜在成像深度达到几十微米之后，即使在同样的条件下，荧光信号的强度会急剧减弱，因此限制了深度成像的应用范围。

而双光子荧光显微镜能够在成像深度达到1mm时，仍然能够获得较高的荧光信号强度和分辨率。

三、双光子荧光显微镜的应用1. 细胞成像双光子荧光显微镜能够对单个细胞进行成像，展示细胞内分子的构成和运动过程，以及细胞能量代谢和信号传递的机制等。

次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用

次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用中文摘要双光子吸收技术自问世以来一直受到了广泛的关注。

与单光子吸收材料相比，双光子吸收材料在分辨率、穿透深度具有显著的优势，可以用于显微成像、微纺织技术、三维数据存储、光限幅、上转换发光、光动力学治疗以及药物靶向释放等诸多领域。

特别是双光子显微技术，以近红外的激光为光源对生物样品进行成像，具有穿透性强，空间分辨率高，背景荧光干扰小，以及对生物样品的光损伤较小等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

然而，传统的双光子材料常常具有大共轭结构，水溶性差、细胞穿透能力差、生物毒性也较大，并不适用于生物成像。

因此，设计合成具有较高双光子吸收截面的有机小分子用于生物体内细胞、血管、组织成像，具有重要的研究价值。

本文设计合成了两种具有双光子吸收特性的荧光小分子，对其发光性能进行了系统的研究，探索它们在生物成像中的应用。

具体的研究内容包括：1、设计合成了一类以寡聚苯乙烯为骨架的双光子次氯酸荧光探针OPV-HOCl，并将其应用于活细胞及组织内的双光子成像。

在寡聚苯乙烯骨架上引入次氯酸识别基团——氧硫杂环戊烷，通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS 对其结构进行了表征，并通过紫外光谱、荧光光谱等进一步研究了该探针对次氯酸的响应性能，测定了其双光子吸收截面。

加入次氯酸以后，探针分子末端的氧硫杂环戊烷基团被氧化，并生成醛基。

由于分子内强烈的电荷转移导致产物的双光子吸收截面提高了近15倍（从78.9GM提高到1131.5GM），因此OPV-HOCl可以作为一个双光子“turn-on”型次氯酸荧光探针。

此外，该探针还具有反应速度快、选择性好、pH适用范围宽等优点。

MTT实验表明该探针具有较小的细胞毒性。

由于该探针优异的次氯酸响应性能和较小的生物毒性，我们成功地将其用于小鼠胶质瘤细胞BV-2中次氯酸的检测，研究表明该探针可以透过细胞膜，并对细胞中外源性次氯酸和脂多糖诱导产生的内源性次氯酸具有高选择性的快速响应。

双光子荧光原理

双光子荧光原理
《双光子荧光原理》
嘿，大家知道吗？今天我来给你们讲讲双光子荧光原理，这可真是个神奇的玩意儿啊！
就说有一次我去实验室，看到那些科学家们在捣鼓一些奇怪的仪器。

我凑过去一看，嘿，他们正在研究双光子荧光呢！我就好奇地问：“这到底是咋回事呀？”科学家笑着跟我说：“别急，听我慢慢道来。

”
然后他就开始给我解释啦，说这个双光子荧光啊，就像是一场特别的灯光秀。

你可以想象一下，在一个黑黑的地方，有一些小小的分子，它们就像一个个小演员。

当有特定的光照射过去的时候，这些小演员就开始活跃起来啦！它们会吸收两个光子，然后发出特别亮特别神奇的荧光。

就好像这些小演员突然被点亮了，开始闪闪发光。

我当时就觉得，哇塞，这也太有意思了吧！就好像是在黑暗中突然出现了很多美丽的小星星。

然后科学家还说，这个原理在很多领域都有重要的应用呢，比如医学啦、生物学啦等等。

我听了之后真的是大开眼界啊，原来这么一个看似深奥的原理，其实也可以这么有趣地去理解呀！这就像是生活中的很多事情，当你深入去了解的时候，总会发现一些意想不到的惊喜和乐趣。

哎呀，这双光子荧光原理，真的是让我又长了不少见识呢！我想我以后看到那些闪闪发光的东西，都会想起这个神奇的原理啦！哈哈！
怎么样，我讲得够通俗易懂吧，希望你们也能像我一样对双光子荧光原理感兴趣哟！。

双光子荧光显微镜的研究

浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。

ｍ＝叫２吨。

篙ｅｘｐｆ（２Ｂ．４）山§２２的分析可以知道，这里口；为一比例系数，与单光子探测系统有关；口，现对单光子荧光强度和双光子荧光强度在径向作一比较，令公式（２．３．３）和（２．３．４）中的ｚ＝Ｏ，可以得到荧光光强的径向分布方程分别为：Ｌ。

，叫ｏｅｘ。

吲旺，ｓ，Ｌ。

胁，叫。

２唧陶㈦，．ｓ，（ａ）（ｂ）图２—３荧光强度径向归一化分布（ａ）甲光子荧光光强径向归～化分布（ｂ）双光予荧光光强径向归～化分布蔫浙江大学顺士学位论文第三章双光于实验系统简介第三章双光子实验系统简介在了解了双光予成像理论的基础上，介绍实验中双光子成像系统的流程以及备个组成部分。

通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。

本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。

§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。

其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。

图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。

由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。

由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。

双光子激光扫描荧光显微镜及其应用

表 1 几种常见荧光分子的单光子、双光子和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单、双光子激发过程示意图
图 2 单、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面、准确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源

双光子显微镜

双光子显微镜/view/1428311.htm?fr=ala0_1双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。

双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。

双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。

这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。

在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。

所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：一是标记染料的光漂白现象。

因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。

光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。

在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。

双光子用荧光染料

双光子用荧光染料
双光子荧光染料是一种特殊的光学染料，可以在双光子激发条件下发出荧光。

这种染料在生物学和医学领域有着广泛的应用，例如用于荧光显微镜、荧光寿命成像、荧光共振能量转移等技术中。

双光子荧光染料具有较深的组织穿透能力和较高的空间分辨率，因此在活体成像和体内成像中有广泛应用。

例如，可以用于标记细胞或组织中的特定分子、蛋白质或其他生物大分子，从而观察它们在生物体内的动态变化和功能。

此外，双光子荧光染料还可以用于制作光动力疗法药物，这些药物可以在特定波长的激光照射下产生单线态氧，从而杀伤肿瘤细胞或破坏病变组织。

需要注意的是，双光子荧光染料通常需要在特定的实验条件下使用，例如特定的激光波长和功率、特定的染料浓度和标记方式等。

因此，在使用双光子荧光染料时需要仔细选择和优化实验条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。

一种有机化合物双光子荧光现象的实验研究

一种有机化合物双光子荧光现象的实验研究有机荧光材料在现代科学中具有重要意义。

它们不仅用于高灵敏度的内部化学传感器，还可用于生物成像和光子检测器。

有机双光子荧光（DPF）是一种利用光子效率更高形成双光子荧光的光学现象，广泛用于激发效率和信号强度提高的研究领域。

因此，研究有机荧光材料的双光子荧光现象是开发高效率的有机荧光传感器的关键。

本文的研究旨在建立一种有机化合物双光子荧光现象的试验研究。

有机物结构是由吡咯烷基苯乙酸（PPhE）构成的，荧光研究中，PPhE将在体外条件下稳定悬液，并在365 nm的太阳光谱下进行荧光激发，以研究双光子荧光。

首先，本实验将研究有机物PPhE的双光子荧光现象的最佳条件。

然后，以不同溶液浓度的组合，并在不同时间、不同温度等变量下进行实验，以观察有机物PPhE的双光子荧光现象。

此外，研究所观察到的双光子荧光谱波数和荧光强度也将进行测量。

1000ppm溶液的结果表明，双光子荧光光谱随溶液温度的升高而逐渐变弱，但随溶液时间的延长而增强，最终达到一个最大值。

该信号最大值出现在2小时的温度下，双光子荧光光谱的波数为519 nm，荧光强度为0.581。

而在温度为25度的实验中，双光子荧光光谱的波数达到524 nm，荧光强度为0.612。

而4000ppm溶液的实验结果表明，双光子荧光光谱的波数为525 nm，荧光强度为1.050。

实验结果表明，有机物PPhE的双光子荧光可在体外条件下稳定悬液，并在365nm的太阳光谱下激发，双光子荧光光谱的波数和荧光强度随溶液时间的延长而增强，最终达到一个最大值；且随着溶液浓度的提高，双光子荧光光谱的波数和荧光强度也随之提高。

此外，本文的研究将为有机物的双光子荧光的进一步应用奠定基础，在激发效率和信号强度提高的研究领域，PPhE木有机物将可用于开发高效率的有机荧光传感器。

综上所述，这项研究为开发有机荧光传感器提供了重要信息，同时也为有机物的双光子荧光探究奠定基础。

吡啶星型分子的双光子上转换荧光特性

可用于研究活细胞内化学过程的实时单分子显示．生物双光子成像技术要求荧光材料的量子产率高，溶解性和光稳定性好，在红外或近红外波段线性透过率高，双光子吸收截面大．因此从分子水平上设
计、研究对生物体系中的生理病理学标记物具有特异性结构和位点识别功能的双光子荧光分子一直是人们关注的热点问题．
乙烯基｝苯基｝１３４嗯二唑（ｙＡＰ）一，，－ＰＰＳＯ的双光子吸收截面及上转换荧光光谱．采用非线性透过率法测得二
氯甲烷和四氢呋喃溶液中其双光子吸收截面分别为４２５和２８８Ｇ１．８．Ｍ．系统研究了吡啶星型分子ＰＰＳＯｙＡＰ
用前经回流脱水处理．产物的红外谱图在Ｎｃｌ５ｉｅ７０型红外光谱仪上测得；核磁共振谱在Ｂｕｋｒ（０ｏｔｒｅｅ型３０ＭＨｚ核磁共）
振仪上测得，ＣＣ溶剂，ＴＳ为内标，点由Ｘ－双目显微熔点仪测定；质谱在ＴＱＱａ — 以Ｄ１为Ｍ熔Ｔ４型Ｓｕｎ
联系人简介：钱
鹰，女，博士，教授，博士生导师，主要从事有机光电功能材料的研究
钱
鹰等：吡啶星型分子的双光子上转换荧光特性
８９６
１实验部分
１１试剂与仪器．
三（．邻甲苯基）膦、醋酸钯和４乙烯基吡啶均购自Ａｆ公司，分析纯．溶剂均为国产分析纯，一ｌａ使

双光子荧光ppt课件

3.2 优点
• (4)双光子荧光可以避免普通荧光成像中的荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题；
Has not been difficult, then does not have attains
1990年,美国康奈尔大学Denk等提出将双光子激发现象应用到共焦激光扫描显微镜中,开辟了双光子荧光显微和成像这个崭新的领域。
Has not been difficult, then does not have attains
Has nttains
图2a 双光子吸收图2b 单光子吸收 S 单重态能级 T 三重态能级 V 虚拟中间态 hv 吸收光能量 Fl 荧光 Ph 磷光 Ⅺ 系间窜越
荧光物质在吸收了与其能级结构匹配的能量后，电子由基态 S0被激发至激发态S1，经过辐射跃迁后电子又回到基态S0，这一过程中发射出荧光。与单光子荧光不同，双光子吸收过程中，基态与激发态之间存在一个虚能态, 通过两个光子的能量进行叠加而使处于基态的电子达到激发态。
Has not been difficult, then does not have attains
3 双光子荧光的特点及优点
3.1 特点：
(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区 (≥800nm)；
(2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；
Has not been difficult, then does not have attains
Has not been difficult, then does not have attains
2 双光子荧光基本原理
2.1 单、双光子荧光的介绍
• 在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个荧光光子，就是单光子荧光。

双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜

双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
院系：生命科学联合中心
仪器编号制造商国别经费来源责任教授
201214339 德国科研专款或基金程和平
所属ห้องสมุดไป่ตู้实验室制造厂商单价存放地点
北京大学生命科学联合中心蔡司 402.82万元型号购置日期 LSM 710 NLOFLIM 2012年11月
程和平否程和平服务对象电子邮件 — chengp@ 收费标准联系电话 62765957 — 开放时间 —
608
双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
主要研究方向在研或曾承担重大项目奖项专利人才培养相关科研信息学术论文
线粒体超氧炫、钙离子活动的机制和生理功能，活细胞内CaMKII酶活性和ATP浓度成像
国家基础研究项目（“973计划”）
— 博士生4人，硕士生2人
—
知名用户共享信息备注是否对外开放联系人
英杰交流中心335E
基本信息
技术指标及功能简介
红外飞秒激光，可见激光， 34 通道光谱检测系统， 10 种染料可用同一时间精确区分，电动显微镜， FLIM荧光寿命成像系统。细胞自身荧光寿命分析，自身荧光对于标记荧光的有效区分活细胞钙离子浓度测量,共振能量转移，局部氧气浓度测量。光谱范围 350nm-1100nm ；覆盖近紫外、可见光、近红外波段。其光谱分辨率 3nm ，采用 x 、 y 轴独立双镜扫描；Coherent- Chameleon Vision II红外飞秒脉冲激光器，波长范围：680-1080nm，包含色散补偿功能；双光子显微镜提供反射和透射的 NDD 通道；32通道可见光光谱成像；TCSPC设备时间通道宽度最小可达813fs，荧光寿命图像最高分辨率可达 8192×8192。

OLYMPUS双光子系统仪器介绍和主要技术指标

OLYMPUS双光子系统仪器介绍和主要技术指标一、工作条件：1、适于在电源220V（ 10％）/50Hz、气温摄氏+18℃～＋25℃和相对湿度小于70％的环境条件下运行。

能够连续正常工作。

2、配置符合中国有关标准要求的插头，如果没有这样的插头，则需提供适当的转换插座。

3、安装位置要避免建筑高层或靠近震动源，避免水源、灰尘和阳光直射。

二、设备用途：1)细胞形态及功能观察：对活细胞和组织或细胞切片进行多种方式的连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统等三维图像的展示。

2)三维重建功能：可以实现不同层面信息观察，更高灵敏度、高分辨率图象、同时具有高对比度等突出优势，更好的保护样品。

3)多维图象的获得：如X，Y，Z，λ，t)， xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。

4)生物信号测量和分析功能：细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，细胞器和荧光蛋白的共定位分析，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化，进行荧光能量共振转移等功能的分析。

5)多重荧光观察：荧光标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察。

6)快速的光刺激光漂白，FRET、FLIP、Uncaging等高端实验7)invivo 活体观察：双光子共聚焦能实现600μm以上的观察深度，远远超过单光子100μm的观察深度，能够对活体动物直接进行观察。

8)定点的光漂白或刺激：由于双光子具有天然的空间选择性，所以可以做单光子无法进行的空间的光操作，对活体或组织的结构进行光漂白或刺激。

三、系统构成及技术要求双光子共聚焦显微镜是在单光子共聚焦显微镜的基础上发展起来的，其包括一套完整的单光子成像系统和一条完整的双光子成像系统，具有更深的观察深度，更好的空间选择性，对标本进行定点的光操作。

A、双光子激光器及光强调节单元1．双光子激光强度AOM调节系统：保证对红外激光的快速开关和0.1%量级的激光强度调节。

双光子荧光

双光子共焦激光扫描荧光显微镜的应用
application
钙离子通道的观察--贝尔实验室研究了活体大脑皮层神经元细胞内的钙离子动力学情形. 对活老鼠大脑作标记后,拨弄老鼠的胡须以产生刺激,观察到发生在大脑细胞神经元间突触的活动,成像深度可深达大脑240μm。
三维高密度存储及微细加工--由于双光子激发具有有效作用体积小的特点,避免了层与层间的相互干扰,极大地提高了数据存储密度.
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3 双光子荧光的特点及优点
3.1 特点：
(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区 (≥800nm)； (2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；
一成功用于双光子显微镜的双光子探针。
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双光子荧光探针的研究领域
双光子葡萄糖示踪器
具有良好的光稳定性，能够持续监控正常细胞与结肠癌细胞摄入葡萄糖的过程，能够成像观察癌细胞与结肠癌深处抗癌剂的能力，为癌症的早期诊断提供帮助双光子巯基探针根据探针与巯基反应后荧光增强，可用双光子显微镜探测活体细胞与组织90-180μ m深处的巯基成像情况双光子半胱氨酸探针根据醛基（sp2）与半胱氨酸反应后转变为叔甲基(sp3)而丧失吸电子效应这一原理实现
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
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双光子生物荧光显微技术中的探针问题

第23卷　第1期大学化学2008年2月今日化学双光子生物荧光显微技术中的探针问题于晓强　陶绪堂　蒋民华(山东大学晶体材料国家重点实验室　济南250100) 摘要　近年来,双光子材料及其相关应用技术的研究引起了人们的广泛关注,并取得了很好的进展。

其中,双光子生物荧光显微技术受到了特别重视。

本文重点介绍这一技术在生物荧光成像方面的优势,同时深入探讨了该技术面临的缺乏高效双光子荧光探针的问题,总结了双光子荧光探针材料的发展现状和前景。

活性生物组织与细胞及其内部物质(离子、蛋白质、酶、核糖核酸等)的纵深方向的大深度、高精度的断层荧光探测和成像,是医学与生命科学领域面临的挑战性课题。

20世纪80年代发展起来的新型高精度显微镜———激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal m icr osco2 py),辅以可与被测物质特异性结合的各种荧光探针或标记染料,可以对活细胞的结构及其内部物质进行实时动态的观测和检测[1]。

激光扫描共聚焦显微镜依赖小孔光阑成像原理隔离背景光并实现纵深方向的断层扫描。

但这一技术依然存在明显缺点:生物组织和细胞内蛋白质氨基酸残基和血红蛋白等生物大分子发色团对紫外2可见区激发光的吸收、细胞和组织瑞利散射、检测器端共焦小孔光阑对荧光收集效率的强烈损失(只对未经散射的光子成像)、焦平面外的激发区域背景荧光干扰和光生物损伤区域大等。

最近,以脉冲激光为激发光源的双光子荧光探测和成像技术的出现为解决这些问题带来了希望,目前已有商品双光子荧光显微镜出售[2]。

但双光子荧光探针的研究则相对滞后[3],已有的针对激光扫描共聚焦显微镜的单光子荧光原理开发的商品探针的双光子荧光活性吸收截面偏小,因而所用激发激光的光强偏大,易造成生物样品热损伤,限制了双光子荧光显微技术的广泛应用。

从目前的应用效果看,激光扫描共聚焦显微镜可以在二维平面上给出高精度的荧光成像,但在三维成像方面仍然存在着不足之处。

基于双光子荧光的三维成像装置以及成像方法[发明专利]

专利名称：基于双光子荧光的三维成像装置以及成像方法专利类型：发明专利
发明人：刘伟伟,周朗峰,陈平,孙陆,林列
申请号：CN201710734908.9
申请日：20170824
公开号：CN107677653A
公开日：
20180209
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及双光子荧光成像，提供一种基于双光子荧光的三维成像装置，包括激光器以及水槽，还包括荧光激发光路以及荧光接收光路，荧光激发光路包括焦点调节组件，荧光接收光路包括探测器，且于激光器与焦点调节组件之间的光路上设置有第一透镜，于焦点调节组件与水槽之间的光路上设置有第二透镜，于滤光片与探测器之间的光路上设置有第三透镜；还提供一种成像方法。

本发明的激光器发出光在发散后通过焦点调节组件调节发出光水槽内荧光染料中焦点位置，且通过移动激发光在荧光染料中聚焦点位置，在发出光的焦点位置双光子被吸收，进而产生双光子荧光，双光子荧光的激发光波长较长，具有很深的穿透深度，可以在荧光染料内部形成任意的三维荧光图像。

申请人：南开大学
地址：300071 天津市南开区卫津路94号南开大学
国籍：CN
代理机构：深圳市科进知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：赵勍毅
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