SERS标记的金纳米棒探针用于免疫检测

2009年第67卷化学学报V ol. 67, 2009第14期, 1603～1608 ACTA CHIMICA SINICA No. 14, 1603～1608

* E-mail: jwhu@

Received March 2, 2009; revised April 5, 2009; accepted May 7, 2009.

1604化学学报V ol. 67, 2009

荧光谱峰较宽, 信号的选择性相对较差; 若用荧光分子标记, 还存在光解和光致褪色现象, 因而荧光标记技术亦有其局限性. 基于表面增强拉曼散射(SERS)的SERS 标记技术是一种光谱标记技术, 始建立于20世纪80年代末[8]. 它利用金或银等贵金属纳米颗粒来增强/放大表面吸附的拉曼活性分子的拉曼信号(即SERS), 以拉曼活性分子的SERS信号作为读出示踪信号. 近年来随着纳米科技的快速发展, SERS标记技术已引起了国内外科学家的广泛关注[9,10]. 首先, 拉曼光谱具有高度的分子特征性, 且谱峰窄, 能减小不同分子间的谱峰重叠. 其次, 在多元检测中一种波长的激发光就能激发出不同的拉曼活性分子的谱峰. 第三, SERS信号很少受光漂白的影响, 可在一定程度上为获得较好的SERS信号而延长积分时间. 第四, SERS信号不象荧光分子那样易发生自淬灭现象, 可通过增加拉曼活性分子数目来提高信号强度, 从而提高免疫检测的灵敏度.

目前, SERS免疫检测呈现几个基本的发展趋势[11]. 第一, 如何解决SERS标记免疫探针在固体基底上非特异性吸附造成的“假阳性”问题. SERS免疫检测的基本方法是标记抗体, 待测抗原和俘获抗体之间形成“三明治”夹心结构. 理想情况下, 探针上的抗体通过抗体和抗原之间的特异性免疫反应连接到俘获抗体上. 除此以外的吸附为非特异性吸附, 由此造成假阳性和背景信号升高等. 通常可利用牛血清白蛋白来封闭固体基底上的空位以减少非特异性吸附. 第二, 实现从单组分到多组分检测. Ni等[12]最早尝试了双组分检测. 国内顾仁敖课题组[13]也成功地进行了二组分检测, 并初步进行了三组分检测的尝试[11]. 第三, SERS探针的表面修饰. SERS 纳米探针的表面修饰可以减少标记分子从纳米颗粒表面脱落, 提高信号的稳定性, 并能有效减少探针的非特异性吸附问题. 除此以外, 探针还应具备水溶性、抗团聚和生物亲和性的特点. 目前, 表面修饰的发展趋势是从第一代裸纳米颗粒探针[12～15]到第二代的SiO2修饰的探针[10], 再到第三代高分子包覆的纳米探针[16]. 我们在前期的工作中已明确: 可将胶体的空间稳定理论作为设计制备各类纳米探针的理论依据[17], 即将生物亲和性高分子吸附在纳米颗粒/探针上, 以其提供的空间稳定来取代探针原来的电荷稳定机制. 由于稳定机制不同, 高分子稳定的纳米探针可以耐受高浓度盐等苛性条件而不团聚, 还可提供水溶性和生物亲和性等诸多优异的性能. 第四, 提高免疫检测的灵敏度. 由前述SERS免疫检测的基本方法可知, 提高免疫检测灵敏度实际上就是要提高SERS信号强度. 因此通常选择具有较大拉曼散射截面的分子作为标记分子. 除此以外, 另一个方案是全面借鉴SERS领域的研究成果, 采用具有较强增强能力的纳米颗粒来制备探针. 如Porter等[18]采用60 nm 的金颗粒来制备SERS免疫探针. Cao等[19]和徐等[20,21]则利用银染色技术来提高SERS信号. Cui等[22]采用表面具有孔洞的银核金壳颗纳米粒子来制备探针. Ji等[23]则采用金核银壳纳米颗粒来制备探针, 可通过改变Au/Ag 核与壳的厚度从而获得强的SERS信号. Sanles-Sobrido 等[24]采用颗粒聚集体来制备探针.

金纳米棒有着独特的光学性质, 并且在医学、传感和化学分离等方面有很好的应用前景, 近年来已成为人们研究的热点[25]. 金纳米棒有两个等离子体共振(SPR)吸收带: 横向SPR吸收峰和纵向SPR吸收峰, 其中纵向等离子体吸收峰的位置可以随其长径比的增大而逐渐红移[25]. 金纳米棒SPR的这种可调性使其能作为很好的SERS基底. 因为按照SERS的电磁场增强机制, 当激发光和SPR共振时, 可以最大程度提高单个纳米颗粒的增强能力[26]. 我们最近的实验和理论计算也证实: 当金纳米棒纵向SPR与632.8 nm的激发光耦合时, 其增强能力确实比耦合程度小或没有耦合时强[27]. 因而, 我们制备了长径比为2.5的金纳米棒, 使其纵向SPR和632.8 nm的激发光耦合. 并以此金纳米棒来制备SERS纳米探针, 进行SERS免疫检测研究.

1 实验部分

1.1 实验试剂

氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硼氢化钠、硝酸银、抗坏血酸(AA)均为分析纯, 购自上海国药集团化学试剂有限公司. N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)为分析纯, 购自上海共价化学科技有限公司. 对巯基苯甲酸(MBA)、3,3'-二硫代二丙酸(99%)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)购自Aldrich公司. 羊抗鼠IgG、小鼠IgG、牛血清蛋白(BSA), PBS缓冲液(pH＝7.2)购自北京鼎国生物技术有限责任公司. α-甲氧基-ω-巯基聚乙二醇(mPEG-SH, M W＝5000)由北京建凯科技有限公司特定合成. 四氢呋喃(THF)、丙酮、正己烷购自天津大茂化学试剂有限公司. 玻璃镀金基底由中国科学院安徽光学精密机械研究所提供. 先在清洗干净的玻璃片基底上真空镀上Ni-Cr层, 其上再镀上金. 实验用水为Mini-Q超纯水, 电阻率大于18.0 MΩ•cm－1.

1.2 3,3'-二硫代二丙酸丁二酰亚胺酯(DSP)的制备

0.4836 g 3,3'-二硫代二丙酸(2.3 mmol)溶于50 mL THF中, 向其中加入0.575 g (5 mmol) NHS, 在0 ℃下再加入1.03 g DCC (5 mmol), 在冰浴条件下搅拌反应36 h. 过滤除去副产物N,N'-二环己基脲(DCU), 将滤液旋转蒸发除去THF. 用丙酮/正己烷重结晶两次后得到白色固