引物探针设计培训资料ppt课件
《探针培训资料》课件
入侵检测
探针可以快速检测异动流量和恶意流量，及时发现 并应对潜在的攻击行为。
数据篡改检测
探针可以对网络数据进行检测和比对，及时发现异 常和篡改行为，保证数据的完整性和可靠性。
行为审计
探针可以对用户行为进行记录和分析，及时发现和
探针培训资料PPT课件
欢迎学习探针培训资料PPT课件！本课程将带您了解探针的概念与应用，以 及探针在网络安全中的重要性。
课程概要
本课程将介绍探针的分类和主要功能，以及探针在实战场景中的应用。通过本课程的学习，您将掌握如何安装 配置和使用探针，为网络安全提供保障。
探针的概念和作用
探针是一种网络安全设备，可监控和分析网络流 量，检测潜在的安全隐患，并帮助保护网络不受 攻击。
优点
• 用途广泛 • 功能强大 • 安全高效 • 易于管理
缺点
• 成本较高 • 规则编写复杂 • 攻击方式多变 • 维护工作繁琐
未来发展趋势
• 智能化 • 可视化 • 云化 • 网络化
最后，感谢各位的参与和支持，有任何建议和反馈，请留言或与我们联系。
探针的分类
探针根据功能和应用场景的不同，可以分为机器 学习探针、模型探针和传统探针。
探针的功能
探针在网络安全中有多项关键功能，包括流量监控、流量过滤、攻击检测和行为分析。
1
流量监控
探针可以对网络流量进行监控，监测异
流量过滤
2
常流量并快速响应，为网络安全提供了 极大的保障。
通过设置规则和策略，探针可以对网络
流量进行过滤，按需提取数据，有效提
高了网络的利用效率。
3
《引物设计教程》课件
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
引物探针设计培训资料
全球诊断技术发展的四个阶段
转录介导的核酸恒温 PCR 免疫学诊断 直接培养 （抗原抗体检测， Elisa） RT-PCR （Real Time PCR） 扩增技术 （TMA，NASBA，TMA）
灵敏度低导致漏 检误检等缺陷 检测周期过长 由于成本低，在 发展中国家仍广 泛使用
由于成本低，在 发展中国家仍广 泛使用 “窗口期”问题 是该技术用于血 筛领域的致命缺 陷
总体原则
• • • • • • • • 查阅参考文献，以选取 待检病原体的靶基因。 目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对， 确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因 为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构 检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有 效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导 致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连 续的G） 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
分子信标探针
结构自由能控制在 3~5之间
Non-T7引物
CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTT
T7引物
TAATACGACTCACTATAGGGAGA acctatcctatttgtacatccattca
TMA 检测技术的优势
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA序列的技术。
引物和探针是PCR中的关键组成部分，它们的设计对PCR的灵敏度和特异性至关重要。
引物是专门设计用于扩增目标DNA序列的两个短链DNA片段。
对于PCR反应的成功与否，引物的设计是至关重要的。
在引物设计中，以下几个因素需要考虑：1.引物长度：引物通常由18-24个碱基组成。
引物过短可能导致非特异扩增，而引物过长可能导致特异扩增低下。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与目标序列之间的碱基配对。
避免引物序列中存在重复和寡聚核苷酸，以防止非特异扩增。
3.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物与模板DNA断裂的温度。
引物的Tm值应相似，通常在50-65℃之间。
4.引物之间的互补性：引物之间应避免自身互补或与对方互补，以防止引物形成二聚体或无特异性扩增。
探针是一种带有荧光标记的SSO（特异性杂交寡核苷酸）或DSA（二链特异性杂交寡核苷酸），它能够检测到靶序列的扩增。
探针分为两类：探针（Hydrolysis Probes）和探针（Molecular Beacon Probes）。
1. 探针（Hydrolysis Probes）：这种探针包含一个与靶序列互补的引物和一个结合到引物上的荧光染料和一个淬灭器。
当DNA扩增反应进行时，引物与靶序列结合，使荧光染料与淬灭器距离远离，并发出荧光信号。
这种探针的设计需要考虑引物和探针之间的互补性，以确保特异性扩增和信号产生。
2. 探针（Molecular Beacon Probes）：这种探针是一段独特的DNA 或RNA序列，两端固定一个荧光染料和一个淬灭器。
当探针与靶序列结合时，形成一个折叠的结构，将荧光染料和淬灭器分开。
这种探针的设计需要考虑探针序列的互补性和结构的稳定性。
在引物和探针设计中1.特异性：引物和探针应与目标DNA序列具有高度特异性的互补性，避免与非目标DNA序列发生杂交。
2017第九章 PCR引物及杂交探针设计
miRNAmap :
.tw/
miRBase : /
miRNA引物设计 主讲教师：赵雨杰
由于miRNA序列较短； 由于miRNA存在成熟和颈环序列； 用实时定量PCR检测生物样品中某种miRNA含量 引物设计是比较特殊的； 首先，需完成miRNA逆转录；然后，进行扩增。
2、茎环状结构的RT引物 （ABI产品为主）
由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端 反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个 茎环状结构的RT引物）。另外一条引物3‘端含有6-8 个目标miRNA5'端碱基序列，再加一段随机序列，以 确保引物的Tm值在60℃左右。
美国signosis公司的一种新方法
1. 引物应用模板核酸序列保守区内设计并具有特异性。 2. 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段，产物不能形成二级结构。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。
5. 碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 6. 引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。 7. 引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。 8. 引物5′端可以修饰。 9. 引物3′端不可修饰。
pcr扩增时taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步
PCR引物及杂交探针设计
3. 分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的 发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补 配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。 PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
PCR引物设计及软件使用.ppt
基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件
引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件 快速筛选二聚体引物软件 用于定点突变的引物设计软件 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
碱基的随机分布
引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC
引物的3’端
与目的位点必须完全同源 与非目的位点避免连续5-6bp的同源
引物设计的原则
引物的Tm值
上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5°C 根据Tm值，确定退火温度
∆G值：DNA双链形成所需要的自由能
GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基
在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”
rfbE
检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦
限制检索范围，将结果 锁定于待查目标
非特异杂交
引物、探针设计
查找基因序列 序列分析
引物、探针设计 特异性验证
GenBank
ClustalX
Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold
BLAST
例:根据大肠杆菌rfbE基因序列， 设计引物和探针
1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列
National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心
有名的在线引物设计程序 在线引物设计程序 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件
《引物设计教程》课件
引物长度：通 常为15-30bp， 过长可能导致 非特异性扩增
引物GC含量： 尽量控制在 40-60%，避
免形成二级结 构
引 物 Tm 值 ： 应接近目标序 列 的 Tm 值 ， 以提高扩增效
率
引物3'端：避 免形成发卡结 构，以免影响
扩增效果
引物特异性： 确保引物与目 标序列具有高 度特异性，避 免非特异性扩
增效率和稳定性
引物3'端：避免3'端 出现连续3个或以上 的碱基，以降低错配
率
引物二级结构：使用 软件预测引物二级结 构，避免形成发卡结 构，提高扩增效率
引物特异性：通过 BLAST比对，确保引 物特异性，避免非特
异性扩增
引物浓度：优化引物 浓度，以提高扩增效
率和稳定性
引物纯度：确保引物 纯度，避免污染和降 解，提高扩增效率和
引物GC含量：尽量保持 50%左右，避免过高或 过低
引 物 Tm 值 ： 确 保 引 物 Tm 值在55-65℃之间，以提 高扩增效率
引物特异性：确保引物与 目标序列具有高度特异性， 避免非特异性扩增
引物错配：避免引物内部 错配，以提高扩增效率和 准确性
引物设计软件：可使用 Primer3、OligoT等软 件辅助设计引物
引物设计不当导 致扩增失败
引物设计不当导 致非特异性扩增
引物设计不当导 致扩增效率低
引物设计不当导 致扩增产物长度 不均一
引物设计软件：选择 合适的引物设计软件， 如Primer3、Primer-
BLAST等
引物长度：确保引物 长度在18-25bp之间， 以提高特异性和扩增
效率
引物GC含量：保持 引物GC含量在4060%之间，以提高扩
引物探针设计
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，T aqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般T aqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
PCR引物和探针
引物设计原则：1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100—200片段进行PCR 扩增。
所以引物的选取也要非常的保守.2．上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58—62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3．确保引物中GC含量在30—80%。
应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现.引物的3'端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4．避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体.5．跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。
探针设计的基本原则：1.保守:探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定.理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2。
Taqman探针的长度最好在25—32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃,这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3。
确保探针中GC含量在30-80％。
4.避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基5.探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6。
Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物.两者的距离最好是探针的5'端离上游引物的3’有一个碱基。
7.避免探针与引物之间形成二级结构。
8。
对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
PCR引物设计原理 ppt课件
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点击 2020/12/22 Search，进行引物搜索
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Primer Length常设置在18－30bp, 短了特异性不好，长了没有必要。 当然有特殊要求的除外，如加个酶 切位点什么的。
PCR Product size最好是100－ 500bp之间，小于100bp的PCR产 物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模 糊，不好看。至于上限倒也不必要 求苛刻。
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（3）重复或自身互补序列：
• 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复 性。
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（4）上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任 何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二 聚体。
• 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端 都不能和 其他任何引物互补。
➢ 3’末端的性质非常关键。
➢ 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最 好不要A，或AA等多聚A；
➢ 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列 的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。
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• 当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大 降低；
PCR引物设计原理
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1
➢ PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的 延伸
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
引物和探针设计
引物和探针设计 –PCR 和定量PCR基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录1247基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3'-羟基由相配的引物提供。
引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。
这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。
在延长过程中，RNA 引物降解并由DNA取代。
体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。
通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。
对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素2有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。
它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。
最流行的软件为Primer 3，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。
典型的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。
非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。
应避免编码单一序列和重复序列的引物。
引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。
应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。
最常用的解链温度计算公式显示如下。
“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。
引物探针设计培训资料全
总体原则
• 查阅参考文献，以选取 待检病原体的靶基因。 • 目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对，
确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列 • 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 • 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因
Taqman法荧光PCR 引物探针设计
实时荧光定量PCR TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
身形成环状发卡结构 • 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并
降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引 物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交， 降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 • Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40% －60% • 引物之间的TM相差避免超过2℃ • 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续 相同的碱基 • 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 • Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp • 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
TaqMan法工作原理
每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光
TaqMan 法 PCR反应的建立
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分子信标探针
结构自由能控制在 3~5之间
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Non-T7引物
CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTT
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T7引物
TAATACGACTCACTATAGGGAGA acctatcctatttgtacatccattca
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TMA 检测技术的优势
→领先的 RNA 检测技术 TMA 技术检测病原体 RNA。一个病原体细胞内含有
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TaqMan法优缺点
优点
对目标序列的高特异性 -----阴性结果确定
设计相对简单 ------与目标序列某一区域
互补 重复性比较好
缺点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
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TMA检测技术示意图
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TMA扩增反应原理图
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技术原理
• 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产 生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝， 然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产 生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一 个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩 增循环；同时，带有荧光标记的探针和这 些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光 信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反 映扩增循环情况。
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探针设计原则
• 探针位置尽可能地靠近上游引物 • 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性 • 检测探针的DNA折叠和二级结构 • Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%
－70% • 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5‘G会有淬灭作用，而且即使是被切
TMA技术采用实时荧光检测，仪器自动化程度较高， 解放了操作人员，并且能够得到标准、稳定的结果。
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TMA VS REAL-TIME PCR
都采用实时荧光检测技术
TMA与PCR检测相比较灵敏度更高；特别是加入内标后，PCR检测 灵敏度下降很大
TMA检测产生的放大终产物是RNA，而PCR产生的是DNA；RNA很容易 自然降解，而DNA则较为稳定，即TMA检测在污染控制方面更为容 易
多达 个 RNA 拷贝，大大提高了检测灵敏度。 →先进的恒温扩增技术
核酸扩增在一个温度下进行（42℃），不需要热循环。 →更高的检测灵敏度和准确性
TMA 技术的扩增效率极高，15～30分钟即可将模板扩 增 倍，检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术 。 →有效的解决了核酸检测的污染问题
污染是核酸检测的最大问题。TMA 技术的扩增产物为 RNA ，环境中自然降解，污染少，更进一步提高检测结 果的可靠性。 →高效率的自动化检测
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TaqMan法工作原理
每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光
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TaqMan 法 PCR反应的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，20－30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为58-60℃
身形成环状发卡结构 • 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并
降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核对序列杂交， 降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 • Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40% －60% • 引物之间的TM相差避免超过2℃ • 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续 相同的碱基 • 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 • Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp • 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
割下来还会存在淬灭作用。 • 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，
这时就应选择配对的另一条链作为探针。 • 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发
现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
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引物设计原则
• 序列选取应在基因的保守区段 • 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自
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总体原则
• 查阅参考文献，以选取 待检病原体的靶基因。 • 目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对，
确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列 • 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 • 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因
Taqman法荧光PCR 引物探针设计
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实时荧光定量PCR TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
❖ 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ❖ 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ❖ 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 ❖ Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同