分子细胞遗传学技术与产前诊断-课件
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（2）错义突变（missense mutation）：碱基替换，密码 子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基 酸。
（3）无义突变（nonsense mutation）：碱基替换后， 使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。
（4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变 蛋白质功能的“错义突变”
二、突变分析与分子诊断
（一）基因突变类型
• 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突 变中最多见的形式。
• 稳定突变：传递中不改变原有的突变。 • 动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重
复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生 明显变化。
点突变的结果：
（1）同义突变（samesense mutation）：碱基替换后， 虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码 的兼并性），亦称静止突变。
3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）
基因突变形式—碱基的插入和缺失
• 碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几 个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨 基 酸 序 列 都 发 生 改 变 ， 又 称 移 码 突 变 （ frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。
碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变
分子细胞遗传学技术 与产前诊断
2006年11月
基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系
一、分子细胞遗传学技术
荧光原位杂交技术（fluorescence in site
hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探 针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出 生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500 kb.
细胞遗传学研究中染色体技术的应用
21号染色体涂染探针FISH杂 交，显示21三体
9号染色体涂染探针杂交。 箭头示易位到10号染色体上 的来自9号染色体的片段
比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）
• 近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗 传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不 同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA， 然后与正常人中期细胞染色体杂交。
24种不同染色体涂染探针杂 交得到的彩色染色体
染色体技术的 应用－1
inv(14)(p12q24)
t(2; 11)(2q34; 11q13)
细胞遗传学研究中染色体技 术的应用—FISH技术检出
t(2; 14)
染色体技术的 应用－2
inv(9)(p12q13)
分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失
荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针
• 基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努 力，越来越多的这方面探针可以使用
• 着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体 和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。
• 所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马 林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检 测，利于做回顾性研究。
CGH的局限性：
• 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基 因重排，倍体水平改变。
• 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在， 肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。
• 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 — 30MB）
• 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤 细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。
• 这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。
比较基因组杂交的原理
• 待测DNA（肿 瘤细胞DNA， test DNA)为绿 色 • 参照DNA(正常 细胞DNA， reference DNA） 为红色 • 复染为蓝色
（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现 终止密码产生截短型蛋白
缺失突变
基因突变形式
• 框内突变（inframe mutation）：3个或是 的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因 丢失或增加1个或几个氨基酸。
• DNA 大片段缺失或复制（large deletion or duplication)：几百个bp至几十个kb的碱基 缺失或复制。
• 全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅 含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA 序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中 期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素， 在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。
应用15号染色体一基因特异性 探针（红色）杂交确定其是否 缺失；绿色探针鉴定15号染色 体着丝粒。
各种类型病理性突变的比例
1. 无义突变和移码突变： 60％ 2. 稀有的错义突变： 20％ 3. DNA大片段缺失或重复: 20％
微小突变
4. 另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态 位点
（二）目前常用的对已知点突变的分析技术
• 限制性片段长度多态性（RFLP） • 等位基因特异性（PCR）扩增（ASA） • 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO） • DNA芯片
1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析
• 当突变影百度文库到某一限制性内切酶位点时， 可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制性片 段长度多态性（RFLP）
2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）
• 通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补， 一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物及3’ 端引物进行两个平行的PCR，分析结果。
人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交
A. 中期染色体的DAPI 的
B. 复染图
B. 中期染色体比较基因组杂
交（CGH）：红色区域表 示
丢失，绿色区域表示扩增。
CGH的优点：
• 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体 区带水平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和 定位。
• 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体 瘤尤为适用。
（3）无义突变（nonsense mutation）：碱基替换后， 使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。
（4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变 蛋白质功能的“错义突变”
二、突变分析与分子诊断
（一）基因突变类型
• 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突 变中最多见的形式。
• 稳定突变：传递中不改变原有的突变。 • 动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重
复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生 明显变化。
点突变的结果：
（1）同义突变（samesense mutation）：碱基替换后， 虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码 的兼并性），亦称静止突变。
3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）
基因突变形式—碱基的插入和缺失
• 碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几 个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨 基 酸 序 列 都 发 生 改 变 ， 又 称 移 码 突 变 （ frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。
碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变
分子细胞遗传学技术 与产前诊断
2006年11月
基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系
一、分子细胞遗传学技术
荧光原位杂交技术（fluorescence in site
hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探 针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出 生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500 kb.
细胞遗传学研究中染色体技术的应用
21号染色体涂染探针FISH杂 交，显示21三体
9号染色体涂染探针杂交。 箭头示易位到10号染色体上 的来自9号染色体的片段
比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）
• 近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗 传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不 同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA， 然后与正常人中期细胞染色体杂交。
24种不同染色体涂染探针杂 交得到的彩色染色体
染色体技术的 应用－1
inv(14)(p12q24)
t(2; 11)(2q34; 11q13)
细胞遗传学研究中染色体技 术的应用—FISH技术检出
t(2; 14)
染色体技术的 应用－2
inv(9)(p12q13)
分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失
荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针
• 基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努 力，越来越多的这方面探针可以使用
• 着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体 和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。
• 所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马 林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检 测，利于做回顾性研究。
CGH的局限性：
• 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基 因重排，倍体水平改变。
• 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在， 肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。
• 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 — 30MB）
• 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤 细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。
• 这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。
比较基因组杂交的原理
• 待测DNA（肿 瘤细胞DNA， test DNA)为绿 色 • 参照DNA(正常 细胞DNA， reference DNA） 为红色 • 复染为蓝色
（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现 终止密码产生截短型蛋白
缺失突变
基因突变形式
• 框内突变（inframe mutation）：3个或是 的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因 丢失或增加1个或几个氨基酸。
• DNA 大片段缺失或复制（large deletion or duplication)：几百个bp至几十个kb的碱基 缺失或复制。
• 全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅 含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA 序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中 期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素， 在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。
应用15号染色体一基因特异性 探针（红色）杂交确定其是否 缺失；绿色探针鉴定15号染色 体着丝粒。
各种类型病理性突变的比例
1. 无义突变和移码突变： 60％ 2. 稀有的错义突变： 20％ 3. DNA大片段缺失或重复: 20％
微小突变
4. 另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态 位点
（二）目前常用的对已知点突变的分析技术
• 限制性片段长度多态性（RFLP） • 等位基因特异性（PCR）扩增（ASA） • 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO） • DNA芯片
1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析
• 当突变影百度文库到某一限制性内切酶位点时， 可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制性片 段长度多态性（RFLP）
2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）
• 通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补， 一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物及3’ 端引物进行两个平行的PCR，分析结果。
人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交
A. 中期染色体的DAPI 的
B. 复染图
B. 中期染色体比较基因组杂
交（CGH）：红色区域表 示
丢失，绿色区域表示扩增。
CGH的优点：
• 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体 区带水平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和 定位。
• 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体 瘤尤为适用。