中和抗体测定
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病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
目的
➢评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。 ➢评价OPV的有效性和免疫效果。
适用范围
➢人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。 ➢免疫成功率的监测。
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
必备材料
必备材料
➢ 待检血清（灭活处理） ➢ 96孔微量板
➢ 稀释液（MM）
➢ 细胞悬液5～10×104/ml
匀后，将这个稀释度的血清向下一个稀释度 移0.05ml，至最高稀释孔吹吸均匀后，弃去 0.05ml。
（在微量板上进行，板子标记和稀释详见附录1）
血清对照1∶4 血清稀释1∶4
1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024 血清对照1∶4 血清稀释1∶4 1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024
血清1 ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○ ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○
（注意型别的区分和对应）
➢轻摇混匀后，放入CO2孵箱，培养2～4小时
加入事先准备好的细胞悬液0.1ml/孔
➢Hep-2 : 5～10×104/ml
再次摇匀，密封好放在36.5℃培养5～7天。
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
对照的设立
➢血清对照（ 1∶4），标准血清和待检血清同 时设立
➢细胞对照、稀释液对照 ➢100CCID50的抗原对照
血清5
Ⅰ型板
血清2
血清3
○○○○
○○○○
◎○◎○
◎○◎○
◎○◎○
◎○◎○
○○○○
○○○○
◎○◎○
◎○◎○
◎○◎○
◎○◎○
血清6
血清7
血清4 ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○ ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○
血清8
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释方法示例：
稀释度
1：4 1：16 1：64 1：256
1：1024
稀释液
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
血清
0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 废0.05
移入它孔 （每孔×5） 0.025 0.025 0.025
0.025
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释
➢用排枪向第2排孔及Ⅱ、Ⅲ型板的相应稀释度 的两排孔中，每孔移入0.025ml，原稀释孔保 留0.025ml。
血清5
Ⅰ型板
血清2
血清3
Leabharlann Baidu
○○◎◎
○○◎◎
○○○◎
○○○○
○●●●
●●●●
○○○○
○○●●
○○●●
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血清6
血清7
血清4 ○○ ○○ ○○ ○● ●● ●● ○○ ●○ ●● ●● ●● ●●
血清8
CCID50 100 10 1 0.1 100 10 1 0.1 100 10 1 0.1
中和试验时所用抗原量过大或过小都会影 响血清抗体滴度。每次试验应设病毒对照， 核 对 所 用 病 毒 剂 量 ， 一 般 应 在 32 ～ 3认2可0C。CID50/0.025ml 的 用 量 时 其 结 果 才 被
（病毒滴定对照见附录4）
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
中和作用，
➢向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液 0.025ml （200CCID50） 。
病毒分离技术（四）病 结毒 果滴 判定 断 ——中和抗体测定示意图
100＝1
●●●●●●● ●
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SabineⅠ
●◎◎●◎◎◎ ◎
●●●●●●● ●
●●◎●●◎● ● ◎◎●◎●◎◎ ◎
SabineⅡ
◎◎◎◎◎◎◎ ◎
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➢ 标准血清 （WHO CDC/EPI）
➢ 微量可调式移液器 ➢ 无菌吸尖/无菌吸管 ➢ 无菌1.5ml离心管/试
管
➢ 封板胶带
➢ 标准病毒（Sabin ⅠⅡⅢ） ➢ CO2孵箱 （滴度≥106.0CCID50/ml）
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释（1∶4～1∶1024）
➢每份待检血清的稀释在Ⅰ型板的第1排进行。 ➢0.15ml稀释液，加入 0.05ml的血清，吹吸均
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
病毒滴定对照结果的判断
➢SabineⅠ：取2.75的反对数，即得到攻击病毒的 含量：562CCID50/0.025ml。
➢SabineⅡ：取1.50的反对数，即得到攻击病毒的 含量：31.6CCID50/0.025ml。
➢SabineⅢ：取2.00的反对数，即得到攻击病毒的 含量：100CCID50/0.025ml。
SabineⅢ
◎◎◎◎◎◎◎ ◎
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
Spearsman—Karber公式： LogCCID50=Xm＋1/2d－d（Pi/100）
Xm=所用病毒最低稀释度（最高浓度）的 对数
d=稀释度系数（倍数）的对数。 ∑Pi=各稀释度出现CPE百分数的总和。
病毒分离技术（四）
当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中 有1孔不出现CPE，该稀释度的倒数即为该血清标 本的中和抗体滴度。
血清对照1∶4 血清稀释1∶4
1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024 血清对照1∶4 血清稀释1∶4 1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024
血清1 ○○ ○○ ○○ ○○ ●● ●● ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○
❖每个对照设两孔，血清、抗原的量各为0.025ml/孔， 补加稀释液0.025ml/孔，细胞对照孔的稀释液应为 0.05ml，然后全部加细胞悬液0.1ml/孔，密封后放 34.5℃培养5～7天。
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
结果判定
当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定 最终结果
➢标准血清稀释（根据血清效价而定）
• standard serumⅠ: 1∶8000 • standard serum Ⅱ: 1∶2000 • standard serum Ⅲ: 1∶2000
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
标准毒株稀释（200CCID50/0.025ml）
（病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录2、3）
——中和抗体测定
病毒滴定结果的判定
➢SabineⅠ：
LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+100+25）/100=-2.75
➢SabineⅡ：
LogCCID50=0+0.5-1×（100+75+25）/100=-1.50
➢SabineⅢ：
LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+50）/100=-2.00
——中和抗体测定
目的
➢评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。 ➢评价OPV的有效性和免疫效果。
适用范围
➢人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。 ➢免疫成功率的监测。
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
必备材料
必备材料
➢ 待检血清（灭活处理） ➢ 96孔微量板
➢ 稀释液（MM）
➢ 细胞悬液5～10×104/ml
匀后，将这个稀释度的血清向下一个稀释度 移0.05ml，至最高稀释孔吹吸均匀后，弃去 0.05ml。
（在微量板上进行，板子标记和稀释详见附录1）
血清对照1∶4 血清稀释1∶4
1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024 血清对照1∶4 血清稀释1∶4 1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024
血清1 ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○ ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○
（注意型别的区分和对应）
➢轻摇混匀后，放入CO2孵箱，培养2～4小时
加入事先准备好的细胞悬液0.1ml/孔
➢Hep-2 : 5～10×104/ml
再次摇匀，密封好放在36.5℃培养5～7天。
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
对照的设立
➢血清对照（ 1∶4），标准血清和待检血清同 时设立
➢细胞对照、稀释液对照 ➢100CCID50的抗原对照
血清5
Ⅰ型板
血清2
血清3
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血清6
血清7
血清4 ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○ ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○
血清8
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释方法示例：
稀释度
1：4 1：16 1：64 1：256
1：1024
稀释液
0.15
0.15
0.15
0.15
0.15
血清
0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 → 0.05 废0.05
移入它孔 （每孔×5） 0.025 0.025 0.025
0.025
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释
➢用排枪向第2排孔及Ⅱ、Ⅲ型板的相应稀释度 的两排孔中，每孔移入0.025ml，原稀释孔保 留0.025ml。
血清5
Ⅰ型板
血清2
血清3
Leabharlann Baidu
○○◎◎
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血清6
血清7
血清4 ○○ ○○ ○○ ○● ●● ●● ○○ ●○ ●● ●● ●● ●●
血清8
CCID50 100 10 1 0.1 100 10 1 0.1 100 10 1 0.1
中和试验时所用抗原量过大或过小都会影 响血清抗体滴度。每次试验应设病毒对照， 核 对 所 用 病 毒 剂 量 ， 一 般 应 在 32 ～ 3认2可0C。CID50/0.025ml 的 用 量 时 其 结 果 才 被
（病毒滴定对照见附录4）
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
中和作用，
➢向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液 0.025ml （200CCID50） 。
病毒分离技术（四）病 结毒 果滴 判定 断 ——中和抗体测定示意图
100＝1
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SabineⅠ
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SabineⅡ
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➢ 标准血清 （WHO CDC/EPI）
➢ 微量可调式移液器 ➢ 无菌吸尖/无菌吸管 ➢ 无菌1.5ml离心管/试
管
➢ 封板胶带
➢ 标准病毒（Sabin ⅠⅡⅢ） ➢ CO2孵箱 （滴度≥106.0CCID50/ml）
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释（1∶4～1∶1024）
➢每份待检血清的稀释在Ⅰ型板的第1排进行。 ➢0.15ml稀释液，加入 0.05ml的血清，吹吸均
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
病毒滴定对照结果的判断
➢SabineⅠ：取2.75的反对数，即得到攻击病毒的 含量：562CCID50/0.025ml。
➢SabineⅡ：取1.50的反对数，即得到攻击病毒的 含量：31.6CCID50/0.025ml。
➢SabineⅢ：取2.00的反对数，即得到攻击病毒的 含量：100CCID50/0.025ml。
SabineⅢ
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病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
Spearsman—Karber公式： LogCCID50=Xm＋1/2d－d（Pi/100）
Xm=所用病毒最低稀释度（最高浓度）的 对数
d=稀释度系数（倍数）的对数。 ∑Pi=各稀释度出现CPE百分数的总和。
病毒分离技术（四）
当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中 有1孔不出现CPE，该稀释度的倒数即为该血清标 本的中和抗体滴度。
血清对照1∶4 血清稀释1∶4
1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024 血清对照1∶4 血清稀释1∶4 1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024
血清1 ○○ ○○ ○○ ○○ ●● ●● ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○
❖每个对照设两孔，血清、抗原的量各为0.025ml/孔， 补加稀释液0.025ml/孔，细胞对照孔的稀释液应为 0.05ml，然后全部加细胞悬液0.1ml/孔，密封后放 34.5℃培养5～7天。
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
结果判定
当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定 最终结果
➢标准血清稀释（根据血清效价而定）
• standard serumⅠ: 1∶8000 • standard serum Ⅱ: 1∶2000 • standard serum Ⅲ: 1∶2000
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
标准毒株稀释（200CCID50/0.025ml）
（病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录2、3）
——中和抗体测定
病毒滴定结果的判定
➢SabineⅠ：
LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+100+25）/100=-2.75
➢SabineⅡ：
LogCCID50=0+0.5-1×（100+75+25）/100=-1.50
➢SabineⅢ：
LogCCID50=0+0.5-1×（100+100+50）/100=-2.00