第七章 非水相酶催化
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第7章 酶的非水相催化
4、（正）胶束体系
胶束也称为正胶束或正胶团，是在大量水 溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂， 加入表面活性剂后形成的水包油（O/W）的 微小液滴。 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲 油憎水的非极性基团两部分组成的两性分 子，既能溶解水溶性物质又能增溶疏水性 物质。
正胶束是通过表面活性剂的极性端朝外， 与水结合，非极性端朝内，有机溶剂包在 液滴内部，形成一个非极性的核心形成。 正胶束水相是连续相，有机相是分散相。 酶催化反应时，酶在胶束外面的水溶液中， 疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在 胶束的两相界面中进行。
6、pH“记忆”与pH“忘记”
在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶 的冻干或吸附到载体之前所使用的pH值相 同，这种现象称为pH“印记”或pH“记忆”。
第四节 反胶束体系的酶学研究
反胶束酶催化体系是指在非极性有机溶剂 中，酶分子溶解在由表面活性剂形成的含 水反向胶团内催化底物的转化。
一、反胶束的形成和酶的包覆
4、导电有机聚合物的合成
辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如
丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生 成聚苯胺。 聚苯胺-导电装置 塑料电池, 新型飞机上的电子器件,发光二极管、 太阳能电池以及移动电话和迷你电视的显示屏,导 电塑料制作分子大小的道路
5、发光有机聚合物的合成
辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯
当体系中水和有机溶剂同时存在时，两性 表面活性剂分子溶解于有机溶剂，并能够 增溶一定量的水，随水/表面活性剂/有机 溶剂三相浓度不同，会形成球状或椭球状 的胶束，形成所谓的“油包水”的结构， 即反胶束。
二、反胶束体系的制备方法
（1）注入法：将含有酶的水相注入到含有表 面活性剂的有机相中。 （2）液体萃取法：将含酶的水相与含表面活 性剂的有机相直接接触。 （3）固体萃取相：将酶的固体粉末与含水的 反胶束有机溶剂一起搅拌。
酶的非水相催化(5)
反胶束微粒的大小取决于反胶束的含水量（W0），即反胶束中水分子 数与表明活性剂分子数之比。不同酶有不同的最适W0值，该值取决于表明 活性剂和酶的性质，即反胶束的精品内医核学p体pt 积与酶分子体积要相适应。 6
反应体系中水对酶催化反应的影响
酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行 催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少 的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催 化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还 与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。
极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水， 影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶 的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水 量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介 质中因脱水作用而影响其催化活性。
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物 的分配，从而影响酶的催化反应。
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所 组成的两相体系。 不管采用何种有机介质反应体精系品医，学酶ppt催化反应的介质中都含有机溶剂5 和 一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
7.2 有机介质反应体系（二）
（正）胶束体系 在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表明活性剂
酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水 的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子 需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的 空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。
有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水 含量。
第七章 酶的非水相催化
反应体系中水对酶催化反应的影响
酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行 催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少 的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催 化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还 与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。
极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水， 影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶 的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水 量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介 质中因脱水作用而影响其催化活性。
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物 的分配，从而影响酶的催化反应。
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所 组成的两相体系。 不管采用何种有机介质反应体精系品医，学酶ppt催化反应的介质中都含有机溶剂5 和 一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
7.2 有机介质反应体系（二）
（正）胶束体系 在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表明活性剂
酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水 的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子 需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的 空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。
有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水 含量。
第七章 酶的非水相催化
第七章_酶的非水相催化
第七章 酶的非水相催化
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
拒接翻版
Go Go Go Go Go
1、酶非水相催化的主要内容 2、有机介质中水和有机溶剂对催化反应的 影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 5、酶非水相催化的应用
非水酶学的研究主要内容
第一，非水酶学基本理论的研究，影响酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质； 第二，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论； 第三：应用
一、非水介质中酶的结构与性质
(一) 非水介质中酶的状态 存在状态有多种形．主要分为两大类 第一类为固态酶 它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固 固态酶， 固态酶
(二)非水介质中的酶学性质
有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精 细平衡，从而影响到酶的结合部位，有机溶 剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相 结合的自由能就会受到影响，而这些至少会 部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、 立体选择性、区域选择性和化学键选择性等 酶学性质。
第二节:水对非水相介质中酶催化的影 响
第一节： 第一节：酶催化水相的主要内容
酶在非水介质中，酶存在状态与酶结构发生改变。 用于酶催化的非水介质包括 非水介质包括
有机溶剂体系
• • • • ①含微量水的有机溶剂单相体系； ②与水混溶的有机溶剂和水形成的单相体系； ③水与有机溶剂形成的两相或多相体系： ④胶束与反胶束体系；
超临界流体 气相 低共熔混合体系 又称为非常规介质。
体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶 结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率 也远高于其他类型的固态酶。
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
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1、酶非水相催化的主要内容 2、有机介质中水和有机溶剂对催化反应的 影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 5、酶非水相催化的应用
非水酶学的研究主要内容
第一，非水酶学基本理论的研究，影响酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质； 第二，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论； 第三：应用
一、非水介质中酶的结构与性质
(一) 非水介质中酶的状态 存在状态有多种形．主要分为两大类 第一类为固态酶 它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固 固态酶， 固态酶
(二)非水介质中的酶学性质
有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精 细平衡，从而影响到酶的结合部位，有机溶 剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相 结合的自由能就会受到影响，而这些至少会 部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、 立体选择性、区域选择性和化学键选择性等 酶学性质。
第二节:水对非水相介质中酶催化的影 响
第一节： 第一节：酶催化水相的主要内容
酶在非水介质中，酶存在状态与酶结构发生改变。 用于酶催化的非水介质包括 非水介质包括
有机溶剂体系
• • • • ①含微量水的有机溶剂单相体系； ②与水混溶的有机溶剂和水形成的单相体系； ③水与有机溶剂形成的两相或多相体系： ④胶束与反胶束体系；
超临界流体 气相 低共熔混合体系 又称为非常规介质。
体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶 结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率 也远高于其他类型的固态酶。
酶工程-07-酶非水相催化2
（2）具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性。
（3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或 在酶催化的最适温度附近。 （4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用。
（5）容易获得，价格要便宜。
4
第七章 酶非水相催化
第一节 酶非水相催化的主要内容和特 点
二 、
根据所用非水介质的不同，分为四种：
酶
非
水 相 催 化 的 主 要 内 容
中（ 的四 酶） 催离 化子
液 介 质
概念：是指酶在离子液介质中进行 的催化作用。
5
第七章 酶非水相催化
第一节 酶非水相催化的主要内容和特 点
三
1、酶的热稳定性提高。
、
2、酶的催化活性有所降低。
酶
非
3、水解酶可以在非水介质中催化水解反应的逆反应。
水
相
4、非极性底物或者产物的溶解度增加。
酶催
催化 化反 反应 应都 的要 体在 系一 主定 要的 有反
非
水 有机介质反应体系
介 质 反
（研究最多，应用 最广泛）
应
体 超临界流体介质反
系 应体系
与水溶性有机溶剂组 成的均一体系
与水溶性有机溶剂组成 的两相或多相体系
（正）胶束体系
：
应 体
离子液介质反应体系
反胶束体系
7
第七章 酶非水相催化
第二节 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响 （一）微水介质体系
KLD L
D
Km Kcat
立体选择系数 L-型异构体 D-型异构体 米氏常数 酶的转换数
酶在有机介质与在水溶液中催化比较,
影
由于介质的特性发生改变,使酶的对映体选
第七章 非水相酶催化
1、低水体系
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶 解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体 系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
适宜的温度下进行反应。
第一节 非水酶学概述
Enzyme Engineering
有机介质酶反应的应用现状
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A)
高水分含量体系
A
B
(B、C、D)
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
渗透蒸发法调控水分的原理源自Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的 变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在 该介质中的反应活性愈高。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶
活 50
力
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷）
CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
1
2
3
4
5
6
时间（天）
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶 解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体 系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
适宜的温度下进行反应。
第一节 非水酶学概述
Enzyme Engineering
有机介质酶反应的应用现状
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A)
高水分含量体系
A
B
(B、C、D)
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
渗透蒸发法调控水分的原理源自Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的 变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在 该介质中的反应活性愈高。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶
活 50
力
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷）
CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
1
2
3
4
5
6
时间（天）
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
2015春 第七章 酶的非水相催化 to students
枯草杆菌蛋白酶
核糖核酸酶 酸性磷酸酶 腺苷三磷酸酶 ( F1-ATPase) 限制性核酸内切酶 （Hind Ⅲ） β-葡萄糖苷酶 溶菌酶
正辛烷，110℃
壬烷，110℃，6 h 水，pH 8.0, 90℃ 正十六烷，80℃ 水，70℃ 甲苯，70℃ 水， 60℃ 正庚烷，55℃，30d 2-丙醇，50℃，30 h 环己烷，110℃ 水
water)。
水对有机介质中酶催化反应的影响
2 . 水含量对酶催化反应速度的影响
有机介质中水含量与反应速率的 关系 最适水含量随着溶剂极性的增加 而增加 反应体系的最适水含量与酶的种 类、有机溶剂的种类等变化而有 所差别。
猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚 醇转酯反应速率与水浓度的关系
必需水对酶活的影响：
T1/2 = 80 min
活力剩余95％ T1/2 < 10 min T1/2 = 8 min T1/2 = 1 min T1/2 > 24 h T1/2 < 10 min 活力不降低 活力剩余80％ T1/2 =140 min T = 10 min
2. 酶在有机介质中的底物特异性与选择性
2.1 底物专一性 在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位 与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的 底物特异性会发生改变。
是否存在非水介质能保证酶催化？？
长期的观点认为:
有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思
想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几 乎毫无进展。 • 20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂中仍具有活性。
• 1984年， A.M.Klibanov在Science上发表“Enzymatic
Catalysis in Organic Media at 100℃” ，使原来认为生
酶的非水相催化
水介质酶催化体系中，水 分的影响是至关重要的，要使酶能够表现出最 大的催化活力，确定适宜的水活度就显得十分 重要。不同种类的酶因为其分子结构的不同， 维持酶具有活性构象的必需水量也就不同，即 使是同一种类的酶，由于酶的来源不同，所需 的水量也会有显著不同。 最适水含量：催化反应速度达到最大时的 水含量。最适水含量随溶剂极性的增加而增加。 最佳水活度与溶剂极性大小没有关系，可以确 切研究非水介质酶催化作用，一般控制在0.50.6之间。
2 有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需 水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶 的失活。 极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配 系数。lgP越小，极性越强。 lgP小于2的极性溶剂不宜使用。
在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用 溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。
（三）有机溶剂对酶催化反应的影响 1 2 3 4 有机溶剂对酶结构的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂对酶选择性的影响
酶在非水介质中的存在形式 一、固态酶。 冻干酶粉、固定化酶、结晶酶 以固体形式悬浮在有机溶剂中 二、可溶解酶。 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子—酶复合物 表面活性剂—酶复合物 微乳液中的酶等
（二）水对非水介质中酶催化的影响 酶只有在一定量水的存在下，才能进行催 化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应， 水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度 等都有密切关系。
1 必需水
维持酶分子完整的空间构象所必需 的最低水量。 氢键、盐键等次级键。 在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。 通过必需水的调控，可以调节有机 介质中酶的催化活性和选择性。
2 有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需 水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶 的失活。 极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配 系数。lgP越小，极性越强。 lgP小于2的极性溶剂不宜使用。
在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用 溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。
（三）有机溶剂对酶催化反应的影响 1 2 3 4 有机溶剂对酶结构的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂对酶选择性的影响
酶在非水介质中的存在形式 一、固态酶。 冻干酶粉、固定化酶、结晶酶 以固体形式悬浮在有机溶剂中 二、可溶解酶。 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子—酶复合物 表面活性剂—酶复合物 微乳液中的酶等
（二）水对非水介质中酶催化的影响 酶只有在一定量水的存在下，才能进行催 化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应， 水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度 等都有密切关系。
1 必需水
维持酶分子完整的空间构象所必需 的最低水量。 氢键、盐键等次级键。 在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。 通过必需水的调控，可以调节有机 介质中酶的催化活性和选择性。
第七章 酶的非水相催化
常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙
醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。
在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地
保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接
溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特 性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情 况也有所差别。
极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的 结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化 活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂， 控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子
四、有机介质中酶催化反应的条件及其控制
酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合
成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、
氧化还原反应、裂合反应等。
主要应控制的条件有： 水含量
酶的种类和浓度
底物的种类和浓度
有机溶剂的种类
温度 pH 离子强度
必需水
概念： 紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最 少量水。
构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。
二、气相介质中的酶催化
酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体
或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质
的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水
溶液中的催化作用有明显的不同特点。
三、超临界介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是
化特性
底物特异性 立体选择性
区域选择性
键选择性 热稳定性
酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构 象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。
因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可
第七章 酶的非水相催化
russellrussell将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于44种有机溶剂种有机溶剂二甲基二甲基甲酰胺四氢呋喃乙腈和丙酮甲酰胺四氢呋喃乙腈和丙酮中密封振荡中密封振荡5h5h20h20h和和36h36h离心离心除溶剂冷冻干燥后重新悬浮于缓冲液中以对硝基苯磷酸酯为底除溶剂冷冻干燥后重新悬浮于缓冲液中以对硝基苯磷酸酯为底物测其酶活力物测其酶活力44种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活图图772碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用burkeburke用固态核磁共振方法研究了用固态核磁共振方法研究了胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥向酶胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥向酶粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化发现活性中心的破粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化发现活性中心的破坏是由于干燥脱水和添加有机溶剂冷冻干燥能破坏坏是由于干燥脱水和添加有机溶剂冷冻干燥能破坏4242的活性中心的活性中心冷冻干燥过程中加入冷冻干燥保护剂冷冻干燥过程中加入冷冻干燥保护剂如蔗糖如蔗糖会不同程度地稳定酶的活会不同程度地稳定酶的活性中心结构
•
他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介 电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子 构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠， 但程度远小于冷冻干燥的过程。 • 他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活力的影响。 但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大， 而酶活力却相差4个数量级。因此，他们认为酶分子活性中心的改变不是 导致不同介质中酶活力变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能 是主要因素。 • 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。 这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”(compact)而又有 “柔性”(flexibility)的状态。
•
他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介 电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子 构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠， 但程度远小于冷冻干燥的过程。 • 他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活力的影响。 但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大， 而酶活力却相差4个数量级。因此，他们认为酶分子活性中心的改变不是 导致不同介质中酶活力变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能 是主要因素。 • 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。 这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”(compact)而又有 “柔性”(flexibility)的状态。
第七讲 酶的非水相催化
反胶束体系
①溶剂：
非极性有机溶剂，常用的是六碳以上的直链及支链烷 烃、部分芳香族化合物及卤代烷烃（辛烷、氯仿、二 乙醚），其中正辛烷或异辛烷用得最多
②表面活性剂：
阳离子型(CTAB：溴化十六烷基三甲基胺) 阴离子型(AOT：2-乙基己基-琥珀酸酯磺酸钠) 非离子型（Tween系列） 两性型（卵磷脂）
国内外研究进展：
用酶催化转酯反应拆分外消旋体得高光学纯度对应体 在酶促反应体系中添加ß -糊精可提高对映体的纯度 枯草溶菌素有效催化合成氨基酸及肽的转酯等 杨波等提出了有机溶剂中在脂肪酶的催化作用下含手 性中心碳原子的胺类化合物酰胺化的异构选择性规则 李志远等用胰脂酶在有机介质中催化反应得到高光学 纯度的2-氨基丙醇（R-）和（S+）对映体 宗敏华等探讨了超声辐射对有机相中脂肪酶催化有机 硅醇与脂肪酸反应的促进作用 刘平等研究了有机溶剂中酶催化合成五肽前体的反应
近年来受到人们的普遍关注，其中研究最多的是肽的合成 和脂肪酶的催化反应： Xing等研究了AOT／正辛烷的反胶束体系中α-胰凝乳蛋白酶催 化合成肽衍生物的反应得到56％～88％的产率，而且还对反应 体系的Wo值、反应时间和酶浓度等条件进行了讨论； Chen等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽； Tsai等研究了AOT／异辛烷／磷酸盐缓冲液中脂肪酶催化油脂 水解反应时表面活性剂浓度对脂肪酶水解活力的影响； 李干佐等研究了AOT／异辛烷／水体系中解脂假丝酵母脂肪酶 催化庚酸和庚醇的酯化反应动力学； Rees等研究了阳离子表面活性剂CTAB的反胶束体系中有色黏 性细菌脂肪酶催化癸酸辛酯的合成； 马成松等还研究了辣根过氧化物酶在AOT／水／异辛烷中多底 物酶促反应等。
分析反胶束体系应用较广的原因？
非水相溶剂中的酶催化反应研究
3、超临界介质中的酶催化
温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体 (supercritical fluid)。 超临界流体的许多物理化学性质介于气体和液体之间，并具 有两者的优点，如具有与液体相近的溶解能力和传热系数，具 有与气体相近的黏度系数和扩散系数。同时它也具有区别于气 态和液态的明显特点： （1）可以得到处于气态和液态之间的任一密度； （2）在临界点附近，压力的微小变化可导致密度的巨大变 化。
1、有机溶剂对酶分子表面结合水的影响 有机溶剂的极性越强，越 易于夺取酶分子表面的结合 水，对酶活性的影响就越大。
例如，正己烷能夺取酶分子0.5%的结 合水，甲醇则可以夺取酶分子60%的结合 水。
2、有机溶剂对酶结构的影响
（1）对酶分子表面结构的 影响； （2）对酶活性中心的影响。
枯草杆菌蛋白酶晶体在乙腈溶剂中，原有 的119个与酶分子结合的水分子中有20个 水分子被脱去，12个乙腈分子结合到了上 去，其中4个取代了原来水分子的位置。 辣根过氧化物酶在甲醇中的催化时， 发现甲醇可以进入到酶活性中心，与卟啉 铁配位 。 4个已经分子可以进入到活性枯草杆菌蛋 白酶活性中心，结合位点与抑制剂相似。
3、有机溶剂对酶作用底物和产物的影响
有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。
4、选择有机溶剂必须考虑的因素
（１）极性系数lgP：即一种溶剂在正辛烷/水两相间分配 系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。极性系数 越大，表明其极性越弱，极性系数越小，则极性越强。 一般选用2≤lgP≤5的有机溶剂。 （２） 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性） 例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶 剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作 用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）
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有机介质中的酶促反应
水活度（aw ）是指在一定的温度与压力下，反应体系中水 的蒸气压与同样状态下纯水蒸气压的比值。 水活度是确定酶结合水的多少的一个参数，可以很好的表征 酶分子表面水含量的多少以及水对有机相中酶催化反应的影 响。 当体系的含水量一定时，溶剂的亲水性越强，aw值也越小， 酶的活性越低 。 在含有不同底物的各种有机溶剂中，酶的最适aw一般都在 0.55左右，酶的最适aw与溶剂的极性、底物的性质及浓度 无关。
（五）酶的形态对有机介质中酶催化的影响
非水介质体系中酶的主要存在形式：
①
② ③ ④ ⑤
以固体酶粉的形式悬浮在有机介质中
酶结合在固定化载体上悬浮在有机介质中 修饰酶溶解在有机溶剂中 两相催化系统中，酶溶解在水相 以交联酶晶体或交联酶聚集体的形式悬浮在有机介质中
（六）温度对有机介质中酶催化的影响
酶蛋白 抑制剂
有机溶剂
冻干
枯草杆菌蛋白 酶的分子记忆
水溶液
除去抑制 剂
Enzyme Engineering 第三节 有机介质中酶的性质
四、底物专一性的改变
1.
酶催化的相对专一性的变化
极性较强的溶剂中，疏水性较强的底物易发生反应，反之亦然。
有机溶剂中，酶偏向于作用小分子底物。
2.
Enzyme Engineering
酶 工 程
Enzyme Engineering
第八章 非水相酶催化
Enzyme Engineering 第一节 非水酶学概述
一、背景
20世纪60年代发现几种酶在有机溶剂中仍具有活性。
1984年，A.M.Klibanov在Science上发表“Enzymatic
Enzyme Engineering 第一节 非水酶学概述
二、酶催化反应的介质
水介质 有机介质 非水介质（一定量的水） 超临界流体 气相介质 离子液介质
研究热点：介质工程，溶剂工程。
Enzyme Engineering 第一节 非水酶学概述
三、非水介质酶催化反应的特点
（1）非极性底物溶解度高，酶易回收和再利用。
在低水有机介质体系中，酶的最适温度比在水溶液中的最适温度高 温度也会影响酶的选择性，一般在较低的温度，酶的立体选择性高
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（七）添加物对有机介质中酶催化的影响
在有机介质反应体系中，加入甘油、甲酰胺、多羟基化
合物可提高酶分子在有机溶剂中的稳定性和催化活性。 这些溶剂称为仿水溶剂，一般为强极性有机溶剂。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（四）固定化对有机介质中酶催化的影响
1
两相催化体系中可使酶分子处在水相中，避免变性。
2
3 4 5
固定化载体疏水性越强，有利于酶活性的保持
可使酶改善分散程度，减少底物或产物的扩散限制。 载体性质会影响到酶在有机介质中的反应动力学。 固定化可提高酶在有机介质中的操作稳定性。
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的
变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在
该介质中的反应活性愈高。
lg P lg
有机溶剂在辛醇的分配 浓度 有机溶剂在水中分配浓 度
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
的含水量。
（ 4） （5）
添加干燥剂控制水分的含量。
渗透蒸发法。
Enzyme
渗透蒸发法调控水分的原理
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
脂肪酶活性与水活度的关系
Enzyme Engineering 第二节
3.
有机介质中的酶促反应
水对酶催化反应平衡及立体选择性的影响
调节有机介质反应体系水的活度，可调节反应的平衡点
在含水量很低很窄的范围内，随着水活度的增加，酶对对映异构体
单甘酯、糖酯、磷脂、氨基酸型表面活性剂等。
Enzyme Engineering 第五节 非水相酶催化的应用
添加盐类也可改变酶的催化速度，因为盐可以改变酶分
子表面的离子化状态。
在制备有机介质催化用酶时，加入一些有机物或无机物 可提高酶在有机介质中的催化速度。氯化钾、PEG 在有机介质反应体系中，一定浓度的变性剂可增加酶的
催化活性。盐酸胍
Enzyme Engineering 第三节 有机介质中酶的性质
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶 活 力
50
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷） CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
1
2
3 时间（天）
4
5
6
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
Catalysis in Organic Media at 100℃”
传统的生物催化必须在水溶液中进行的酶学概念发生了
革命性的变化。
Enzyme Engineering 第一节 非水酶学概述
Enzymatic catalysis in organic media at 100℃
猪胰脂肪酶在不同溶剂中加热后酶活性的改变 溶剂1：水或0.1,mol/L磷酸缓冲液； 溶剂2：2mol/L戊醇、三丁醇甘油酯（含0.8%水）； 溶剂3：2mol/L戊醇、三丁醇甘油酯（含0.015%水）；
一、有机介质体系中酶活性的变化
一般来说，酶在有机溶剂中的活性比在水溶液中要低得
多。
原因：
1.
传质障碍；
2.
3.
有机溶剂增加酶促反应的活化能；
酶分子活性中心刚性的增加。
Enzyme Engineering 第三节 有机介质中酶的性质
二、酶的稳定化变化
酶在有机溶剂中的稳定性比在水溶液中的稳定性显著提
解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体
系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
二、有机介质中酶促反应的影响因素
（一）水对有机介质中酶催化反应的影响
1.
水对酶分子空间构象的影响
只有与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活性是至
关重要的，这些对于维持酶活性所必需的最低水量称为必需水， 又称结合水。
Enzyme Engineering 第二节
2.
有机介质中的酶促反应
高。
1. 2.
热稳定性提高； 储存稳定性提高；
3.
对变性剂的稳定性。
Enzyme Engineering 第三节 有机介质中酶的性质
三、pH记忆和分子印记
酶分子记忆原来在水相中的一些特性的现象，称为分子
印记。
利用酶在有机溶剂中具有分子印迹这一特性
，可用来作 为提高或改变有机介质中酶专一性（选择性)的有效手段 。如配体印迹酶。
二、生物表面活性剂的合成
生物表面活性剂是指利用酶或微生物通过生物催化和生
物合成方法得到的具有表面活性的物质，如糖脂类、氨 基酸类、蛋白类等表面活性剂。
生物表面活性剂具有优良的表面性能，抗菌、抗病毒、
抗肿瘤等药理作用。
特点是无毒，可完全降解，不会造成环境污染。 通过酶在非水体系中催化合成的生物表面活性剂主要有
4.
前手性选择性的变化
前手性选择性是指酶催化非手性底物选择性地形成具有一定立体构 型的产物。 溶剂的疏水性增加，前手性选择性降低。
Enzyme Engineering 第三节 有机介质中酶的性质
五、反应平衡方向的移动
在有机介质反应体系中，有机溶剂可明显改变反应的平衡，甚至
可以使一些反应发生逆转。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A) 高水分含量体系 (B、C、D)
A
B
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
1、低水体系
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶
脂肪酶 水溶液
酯的水解
X为O或者NH
脂肪酶 有机溶剂
转酯反应
脂肪酶在水相和有机相中催化的反应
Enzyme Engineering 第三节 有机介质中酶的性质
六、酶促动力学的变化
酶在非水介质中的催化反应符合米氏方程。
底物的种类、溶剂的性质都会影响动力学参数。
非水介质中的最大反应速度较水中明显降低。
2、高水分含量体系
1）非极性有机溶剂-酶悬浮体系
底物 有机溶剂
底物分子以扩散形式通过酶分子表面
酶
产物
的水层进入活性中心，完成催化后再 扩散进入有机相
2）非极性有机溶剂－PEG修饰酶单相体系 3）反胶束体系
界面
有机溶剂 底物
酶
产物
界面
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应