利用赤星病菌毒素快速高通量鉴定烟草抗性种质的方法研究

利用赤星病菌毒素快速高通量鉴定烟草抗性种质的方法研究

孙丽萍1,2，时焦1*，孟坤1,2，雒振宁1,2，张峻铨3，王凤龙1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 10081；

3.山东中烟工业有限责任公司青岛卷烟厂，青岛 266101）

摘要：为寻求一种快速高通量筛选鉴定烟草抗赤星病种质或材料的方法，本研究以烟草（Nicotiana tobacum L.）种质净叶黄、Beinhart1000-1、NC89和G140作为供试材料，利用烟草赤星病菌毒素就烟草种质对赤星病的抗病性鉴定方法进行研究，试验设计3种鉴定方法：毒素液浸根法、毒素液浸种法和毒素培养基法。为验证毒素培养基法鉴定结果的可靠性，对烟草种质材料净叶黄、Beinhart1000-1、NC89、G140、K326、G28和中烟100的室内鉴定结果，与其对烟草赤星病的田间抗性鉴定结果进行相关性分析。结果表明，室内鉴定结果与田间鉴定结果之间极显著相关（r=-0.9588），室内鉴定结果可准确反映烟草种质对赤星病的抗病性。

中图分类号：文献标识码：文章编号：

Investigation on the Method of Rapid Identifying Resistant Tobacco Germplasms to Alternaria alternata by Using Its Mycotoxins

SUN Liping1,2, SHI Jiao1*, MENG Kun1,2, LUO Zhenning1,2, ZHANG Junquan3, WANG Fenglong1*

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Qingdao

Cigarette Factory of China Tobacco Shandong Industrial Co., Ltd, Qingdao 266101, China)

Abstract: In order to find out an approach to rapidly identify resistant tobacco germplasm to Alternaria alternata, tobacco varieties Jingyehuang, Beinhart1000-1, NC89 and G140 were used as test materials. Using toxins produced by brown spot fungus (Alternaria alternata), we carried out a comparative test to choose a better screening method. Three kinds of screening methods were designed: toxins liquid soaking root of tobacco, toxins liquid soaking seeds of tobacco, and toxin-containing medium screening method. To verify the reliability of the toxin-containing medium screening method, Correlation between laboratory test results and field data on tobacco varieties Jingyehuang, Beinhart1000-1, NC89, G140, K326, G28 and Zhongyan100 was analyzed, and correlation coefficient of -0.9588 was found, which suggests the effectiveness of laboratory method is close to those of field.

Keywords: Tobacco; brown spot disease; Mycotoxin; identifying method

烟草赤星病是由链格孢菌[Alternaria alternata (Fries) Keissler]引起的为害相当严重的叶斑真菌病害之一[1-2]。防治该病最经济有效的措施是选育和利用抗病种质[3]。鉴定烟草种质对赤星病抗性的常规方法有3种，一是毒素液浸根法[4]，二是离体叶片接种法（也称悬滴接种法）[5]，三是田间鉴定。这些方法都是利用成苗或成熟烟株或叶片进行鉴定。不仅需要时间长，而且占地面积大。因此，研究简便快捷的烟草抗赤星病种质鉴定方法十分必要。

植物病原真菌能够产生真菌毒素[6]，包括寄主专化性毒素（Host Specific Toxins, HST）及非寄主专化性毒素（Non-Host Specific Toxins, NHST）[7-8]。赤星病菌在寄主体内和培养过程中均可产生毒素[9]。董汉松等[4]利用毒素液浸根法开展了赤星病菌毒素对烟草幼苗致病性的研究，发现烟草品种幼苗对毒素的抗性与悬滴接种法测定的相同品种对病原菌的抗病性一致，肯定了运用毒素筛选烟草抗赤星病种质的可靠性。Ishida等[10]将赤星病菌产生

基金项目：中国烟草总公司科技重点项目（合同号：110201002022）

作者简介：孙丽萍，女，硕士研究生，研究方向为植物病理学。E-mail：sunlpgod@。*通信作者，E-mail：jshi42@；wangfl64@ 收稿日期：2013-01-07 修回日期：2013-03-27

题目

的毒素液加到培养基中，用于培养对烟草赤星病抗性不同的烟草种质的细胞，结果发现，抗病种质细胞的死亡率比感病种质的低很多。郭永峰[11]报道，运用毒素对烟草种质的成熟叶片进行鉴定具有可靠性。Kodama等[12]研究表明，提纯的毒素引起感病种质、中抗种质叶片坏死的浓度分别是1 μg/mL 和20 μg/mL。以前科研工作者只是利用毒素对烟苗或者烟草成熟叶片的抗性水平进行了初步的探索，尚无人利用毒素直接对烟草种子进行鉴定的研究报道。为研制一种既快捷，又节省资源的新方法，我们开展了利用毒素直接对烟草种子进行鉴定的方法研究。

1 材料与方法

1.1 供试烟草种质

烟草种质材料净叶黄、Beinhart1000-1、NC89、G140、K326、G28和中烟100均由国家烟草中期库提供。

1.2 菌株来源

烟草赤星病菌A1号菌株，由中国农业科学院烟草研究所烟草病虫害监测与综合治理重点开放实验室提供。

1.3 毒素液的制备

参照董汉松等[4]介绍的方法并加以修改。首先从培养皿中繁殖的赤星病菌上取1个直径5 mm的菌饼接种于120 mL查彼培养液中，在28 ℃条件下振荡培养4 w，纱布过滤除菌丝体，再经3～5次离心（8 000 r/min，10 min）、镜检无细胞，121 ℃湿热灭菌15～30 min，得毒素液，用生物测定方法[13]确定毒素活性，然后贮藏备用。

1.4 鉴定方法研究

2011年在中国农业科学院烟草研究所开展试验，设置了毒素液浸根法、毒素液浸种法和毒素培养基法3种鉴定方法，并对其进行了研究。

1.4.1 毒素液浸根法将毒素液用无菌水按不同倍比（原液、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64）稀释，设相应稀释倍比的查彼培养液为对照，共14个处理。将2～3叶期烟草幼苗的根部洗净，放入含有8 mL处理液的青霉素小瓶中，每瓶15～20株，重复4次。于25～28 ℃，14 h/d光照条件下培养，培养过程中应及时补足蒸发的水分，96 h后观察并测量根长。以查彼培养液浸种的烟苗根长为对照处理根长，计算毒素液对根长的抑制率[14]。

%

100

-

(%)×

=

查彼液处理根长

毒素液处理根长）

（查彼液处理根长

根长抑制率

采用DPS软件Duncan’s新复极差法（P<0.05）对烟苗根长抑制率进行差异显著性分析。

1.4.2 毒素液浸种法种子经10%H2O2消毒后，放入灭菌的毒素液中浸泡，浸泡时间设4、8、16、24 h，同时设查彼培养液分别浸泡4、8、16、24 h 的处理为对照，共8个处理。各处理按设计时间先浸于毒素或者查彼培养液中，后浸于水中，保证每个处理实际总浸种时间均为24 h。然后取20粒烟草种子置于含水琼脂培养基的培养皿（直径9 cm）内，每皿为1个处理，重复4次。25～28 ℃，14 h/d 光照条件下培养，第20天测量记录根长，并以查彼培养液浸种的烟苗根长为对照处理根长，计算毒素液对根长的抑制率。采用DPS软件Duncan’s新复极差法（P<0.05）对烟苗根长抑制率进行差异显著性分析。

1.4.3 毒素培养基法将同批次未消毒的毒素液与琼脂或者水琼脂混合，配制成不同稀释倍比的含毒素固体培养基：原液（每升毒素液中加入琼脂18 g）、1/2、1/4、1/8、1/16，121 ℃湿热灭菌15～30 min。同时设相应稀释倍比的查彼固体培养基和水琼脂培养基为对照，共11个处理，重复4次。其他操作同毒素液浸种法，以根系紧贴或伸入培养基中的程度以及叶片颜色为鉴定指标，采用DPS软件Duncan’s新复极差法（P<0.05）对根系深入培养基中烟苗的比率进行差异显著性分析。

1.5 毒素培养基法可靠性的进一步验证

为进一步验证毒素培养基法的可靠性，就毒素培养基法对烟草种质材料净叶黄、Beinhart1000-1、NC89、G140、K326、G28和中烟100的室内鉴定