细胞培养基本技术全面知识普及分享资料
细胞培养技术详细学习资料
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上皮型细胞
• 来源：起源于内、外胚层 的细胞，如：皮肤及其衍 生物、消化道、乳腺、肺 泡、上皮性肿瘤等。
• 形态：类似体内的上皮细 胞，呈扁平、不规则、多 角形，中有圆形核。
• 生长特点：细胞紧密相连 成单层膜
相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
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对细胞培养技术的评价
优点：
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动；
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） ； 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）； 利用方法：研究技术、记录方法；
3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物--高等动物--人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤）
缺点： 观察不方便
很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
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培养细胞的生长特点
粘附并伸展 是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞
在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支 持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放 射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类 型生长。 密度依赖性
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悬浮型细胞
概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长。
来源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白细胞 肿瘤细胞为主。
特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，呈单个 或小细胞团。
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优点： 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态
细胞培养基本知识基本技术
– 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成， 这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理
– 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成 会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常 误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批 号的血清
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……
细胞培养技术入门
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其 时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以 求计数准确；
4.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让 悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
5.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚 集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格 线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不 计右线。
用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色， 活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细 胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显 色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、EP 管、毛细吸管等。 2、试剂： SP20细胞、 0.4％台盼（酚）兰其 配方是：台盼（酚）兰 0.4g加双蒸水100ml等。 3、材料：细胞悬液
贴壁细胞
直接去掉上清液
悬浮细胞
离心去掉上清液，必要时做细胞 饲养层以净化细胞
传代
细胞生长80％以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异， 2－3天或1周左右一代
贴壁细胞
消化法，用胰酶－EDTANa2消化，
时间根据细胞而定
悬浮细胞.
直接吹打或离心法、自然沉淀法，
吸一半液到另一瓶
冻存
冻存程序 ★ 细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四个大
格细胞总数，压线细胞只计左侧和上 方的。然后按下式计算：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子 细胞数/4)×稀释倍数×104 /ml
四、细胞计数要点：
1.要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如 果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养 液中；
细胞培养基础知识
计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许； [2] 用移液枪在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢
入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也 不要过少或带气泡； [3] 在显微镜下，用 10×物镜观察，可见细胞均匀分散计数板各处。计算四角大方格内 的细胞数，压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内(即仅计算压两个 边的细胞)，成团细胞按单个细胞计算。按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml＝(四个大格子细胞数/4) ×稀释倍数×104 【注意事项】 [1] 消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 [2] 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤其要注意这一点。否则， 前后计数结果会有很大的误差。 [3] 镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团 10%以 上，说明消化不充分；或细胞数少于 2 个/mm2 或多于 50 个/mm2 时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液、计数。 5 培养细胞的运输 装运细胞的方法有两种，一种为冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存， 保存效果较好，但较麻烦，且不宜长时间运输，多需空运。另一种简单的方法为充液法，步 骤如下： [1] 选择生长状态良好的细胞，可直接根据路程时间来选择接种细胞数量，一般以长满
【概述】
细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态，测定培养 基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞技术有血球计数板计数法和电子 细胞计数仪计数法。 【用品】
血球计数板、吸管、胰酶、培养液、显微镜
【步骤】
[1] 准备计数板：用无水乙醇或 95%乙醇清洁计数板和盖玻片，待干燥后，把盖玻片覆在
《细胞培养基本技术》课件
讨论细胞培养在科学研究和 医学应用中的作用。
细胞培养实验步骤
1
细胞培养器具消毒
2
介绍细胞培养器具的消毒方法。
3
细胞培养
4
将细胞放入培养基中并提供适当的生长条件。
5
细胞准备
从组织样本中提取和准备细胞。
培养基制备
制备适合细胞生长的培养基。
细胞观察与维护
观察细胞生长情况，并进行细胞培养的日常 维护。
细胞培养中常见问题及解决方法
细胞污染
讨论细胞培养中的常见污染源 以及如何预防和解决细胞污染 问题。
细胞死亡
探讨细胞死亡的原因以及如何 识别和解决细胞死亡问题。
细胞特性变异
说明细胞特性变异的原因和影 响，并提供相应的解决方法。
细胞培养的应用领域
医学研究
探讨如何利用细胞培养技术进行疾 病研究和药物筛选。
生物技术
介绍细胞培养在生物技术领域的应 用，如基因工程和重组蛋白制备。
《细胞培养基本技术》 PPT课件
这个PPT课件将会介绍细胞培养的基本技术。通过这个课件，您将了解细胞培 养的背景和目的，并掌握其基本原理和实验步骤。
细胞培养的 细胞培养的重要性
了解细胞所需的培养基成分 和培养条件。
探讨细胞分裂机制以及如何 促进细胞增殖。
组织工程学
讨论细胞培养在组织工程学中的重 要性和应用。
细胞培养中的道德和安全问题
1
动物实验伦理
探讨使用动物细胞进行实验的道德与伦理考
实验室安全
2
量。
介绍细胞培养实验中的安全操作方法和注意
事项。
3
数据和结果处理
讨论研究数据和结果处理的道德和科学性要 求。
总结及未来展望
细胞培养相关知识点
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
第1章细胞培养的基本知识-10页word资料
第一篇细胞工程的基本技术——细胞培养技术第1章细胞培养的基本知识第一节基本概念和名词细胞培养(cell culture)技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
它起源于1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久，第一次获得组织块人工培养成功。
1906年，Beebe和Ewing用盖玻片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时，并曾见到细胞生长现象。
1907年，Harrison用淋巴液做悬滴培养，使来自两栖类胚胎神经组织的神经细胞存活了若干天，还观察到神经管细胞分化成了神经元，而且向培养液中伸出了轴突，与脑、脊神经细胞在体内分化的情况很类似。
以后Carrel进行了改进，并十分注意培养中的无菌操作技术。
他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，通过采用更新培养基和分离组织的传代措施，完善了经典的悬滴培养法。
1923年，他又设计了用骨化瓶培养法，以扩大组织的生存空间。
50年代，组织培养技术有了更快的发展，从改进培养操作技术、培养器皿和培养基方面进行了改进。
各种培养瓶、培养基孕育而生。
1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。
用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line)，通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。
细胞系(cell line)系原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cell strain)系通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
克隆(clone)系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
医学研究中泛指的体外培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养知识大全
细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
细胞培养基本技术
液，加入23 ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞 表面的碎片思考：还有什么作用
加入适量0 1-025％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，
待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液
用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬
果。
•高浓度血清可影响光吸收值;在加入异丙醇溶液或 DMSO前尽量吸净培养液; •吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。
1 5 细胞冻存和复苏
• Spallanzani 1776最早发表了冷处理对“细胞”生命活动影响的报道; • 1900年前后;科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮
1/22/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2 半悬浮生长细胞传代（HeLa细胞） • 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使
细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3 贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用消化液是025％胰蛋白酶液。
消化法传代培养步骤
贴壁生长细胞传代方法
• 存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞
因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
细胞计数
• 具体操作：
1 将计数板及盖片用75%酒精擦拭干净;并将盖片盖在计数板; 2吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满
盖片和计数板之间，静置3 min，注意盖片下不要有气泡，也 不能让悬液流入旁边槽中。 3 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
• 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长约2 min。
活体染色与细胞计数
①将1滴细胞悬液贴壁细胞可经0 25％胰蛋白酶溶液 消化后;吹打制成细胞悬液与2滴台盼蓝液混合后 ，滴入细胞计数板;
细胞培养基本知识分享
细胞培养基本知识分享选择合适的细胞系· 种属非人类和非灵长类动物细胞系通常生物安全性限制较少，但是需要根据要开展的实验来最终决定是否要使用种属特异性培养物。
· 功能特性实验的目的是什么？例如肝脏和肾脏来源的细胞系可能更适合做毒性测试，大脑、脊髓组织来源的细胞多用于神经系统相关研究。
· 有限细胞系还是连续细胞系虽然选择有限细胞系会使您在表达正常功能时有更多的选择，但是连续细胞系往往更容易扩增和维持。
· 正常还是转化细胞转化细胞系通常生长速度较快，接种效率较高，且可连续培养，培养基中需要的血清较少，但是由于遗传转化，其表型已经发生了永久性变化。
· 生长条件和特性对细胞生长速度、饱和密度、克隆形成率以及悬浮生长能力有何要求？例如：要大量表达重组蛋白，可能应选择生长迅速且能悬浮生长的细胞系。
· 其他标准如果使用的是有限细胞系，细胞储备充足吗？细胞系的性质明确吗？需要自己进行验证吗？如果使用的是正常细胞系，有等效的正常细胞系可以作为对照吗？细胞系稳定吗？如果不稳定，那么这种细胞容易扩增以便为实验提供充足的冻存储备吗？获取细胞系可以通过原代细胞建立自己的培养系，或者也可选择从商业供应商或者非盈利性供应单位(即细胞库) 处购买已经建立的细胞系。
声誉良好的供应单位可提供优质的细胞系，而且会认真地对细胞系进行检测，以确保其完好性，并且未被污染。
我们不建议从其他实验室借用细胞，因为这会带来很高的污染风险。
无论来源如何，使用细胞之前都应确保所有新到细胞系已经过支原体污染检测。
培养环境细胞培养的一大优势在于能够控制细胞生长的物理化学环境(即：温度、pH 值、渗透压、O2 和 CO2 浓度)和生理环境(即：激素和营养素浓度)。
除温度外，培养环境均由生长培养基控制。
虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过对血清成分更好地了解、确定细胞增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境(即：细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用)，现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。
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涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿
用自来水冲洗10次，最后蒸馏水冲洗3-5次。 烘干、包装：移液管和滴管的尾端
要塞入棉花。 高压灭菌 烘干备用
30
使用后的玻璃器皿的清洗灭菌
3
细胞培养的应用
1. 药物研究与开发 (1) 新药筛选 (2) 疫苗研究与开发 (3) 基因工程药物研究与开发 (4) 细胞工程药物研究与开发 2. 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 3. 生物制药 (1) 疫苗生产 (2) 基因工程药物生产 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产
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贴壁细胞
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贴壁细胞
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贴壁细胞
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贴壁细胞
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悬浮细胞
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细胞培养的环境
1、无污染环境：化学污染、微生物污染 2、温度环境：37℃。偏离这一温度范围，细胞的正
常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温 的耐受力较对高温强， 3、气体环境： 95%空气加5%二氧化碳 4、酸度环境：大多数细胞的适宜PH 为7.2-7.4，细 胞耐酸性比耐碱性大一些。 5、 细胞培养基：合成培养基、天然培养基。
细胞培养基本技术
1
内容
细胞培养的理论背景
设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
2
细胞培养的概念
20世纪初才创立的一种研究动物细胞行为 的方法。
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体 内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度 和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维 持其结构和功能的一种培养技术。
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需
要。
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人工合成培养基只能维持细胞生存， 要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。
39
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素；
3. 样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。 4.经济、规模和机械化
6
细胞培养的局限性
人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工 所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相 同。缺乏体内的系统作用、失去神经体液 的调节和细胞相互间的影响。 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态 平衡的环境中，必然发生变化。
4
细胞培养的应用
5
细胞培养的优点
1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构 、生命活动 2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等因素 可采用各种研究技术、记录方法： 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细 胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位 素标记等。
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需配制的溶液
平衡盐溶液（PBS或D-Hank’s等） 胰酶 培养基
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溶液除菌方式
高压蒸汽灭菌：平衡盐溶液 过滤除菌：不能高压的溶液，如培养基、
胰酶等
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培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基 和合成培养基。
天培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
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合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，
用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物
7
概念：原代与传代
原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分 开接种到新的培养器皿中。
8
9
培养细胞的生长方式
贴壁生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实
体组织来源细胞、上皮细胞。 悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物 表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
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橡胶和塑料
刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干
。 泡入5％盐酸过夜。 自来水冲洗10次，过蒸馏水3次 烘干 高压蒸汽灭菌 烘干备用
滴管胶头可用75％酒精浸泡5分钟，紫外线照射消 毒。
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水、溶液、培养基
水：超纯水。 至少为三蒸水或去离子水。
刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干。 泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，12小时后从酸缸内捞出器
皿立即用自来水冲洗10次（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃 上难以清洗），过蒸馏水3次。 烘干、包装 高压灭菌 烘干备用
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金属器皿
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂 刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒 精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗 ，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包 装好，高压灭菌，再烘干备用。
滤器
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电动移液器
超纯水仪
25
液氮罐
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培养瓶、培养皿
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实验器材的清洗和灭菌
清洗的重要性
1. 除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等 2. 使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。
不要让污染了的器皿变干！！
灭菌的重要性
除去微生物污染
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酸液配方
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新的玻璃器皿的清洗灭菌
自来水刷洗，除去灰尘。 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12
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细胞培养成功的关键
1. 实验材料的清洗、灭菌。 2. 无菌操作 3. 勤劳
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内容
细胞培养的理论背景
设备与器材准备、溶液配制
无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
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实验设备与器材
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CO2培养箱 超净工作台
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倒置显微镜
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