动物细胞培养的基本技术
动物细胞培养基本技术精讲
潜伏期：
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞潜伏期一 般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
细胞的营养需要 细胞的生存环境
温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒
再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一 2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打 法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
细胞培养基本技术
杂交瘤细胞融合技术
合成培养基： Dulbecco's Modified Eagle's Medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium Medium 199 Earle's Minimum Essential Medium Nutrient Mixture F-10 Ham's Nutrient Mixture F-12 Ham's RPMI-1640 Medium KSOM、CZB、M16、MTF、SOF
结果的分析；易发生支原体污染。
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法 模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和 其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
动物细胞培养的方法
动物细胞培养的方法
动物细胞培养是一种在实验室中进行的细胞生物学技术，可以用来研究细胞的生长、分化、代谢以及毒性等方面。
一般来说，动物细胞培养需要以下步骤：
1. 选择细胞系：选择适合自己研究的细胞系，例如常用的HeLa 细胞、293细胞等。
2. 培养基配制：根据细胞系的需求配制适当的培养基，添加必要的营养物质和能量补给。
3. 细胞分离：用消化酶将组织细胞分离成单个细胞，避免细胞间黏连。
4. 细胞传代：当细胞密度达到一定量级后，需要将细胞传到新的培养皿中，以保证细胞的生长和繁殖。
5. 细胞存储：将细胞冷冻保存以备日后使用。
以上是动物细胞培养的基本步骤，当然在实际应用中还涉及到一些技术细节和技巧，需要不断摸索和实践。
- 1 -。
动物细胞培养技术的发展
动物细胞培养技术的发展随着现代科技的不断发展，动物细胞培养技术正在逐步成为生命科学领域的重要研究手段。
动物细胞培养技术可以使科研人员对生命体内的细胞和分子进行深入的研究，从而更好地理解细胞和生命活动的本质。
本文将简要介绍动物细胞培养技术的基本原理、发展历程以及应用前景。
一、动物细胞培养技术的基本原理动物细胞培养技术是一种将分离的动物细胞放入培养基中，使其在适宜的环境下进行生长和繁殖的技术。
通常情况下，细胞培养基中会添加生长因子、营养物质、激素等物质，以保证细胞的正常生长和分裂。
在培养期间，科研人员可以通过各种手段对细胞进行操控、观察和分析，以获得有关生命体内各种细胞和分子的重要信息。
二、动物细胞培养技术的发展历程动物细胞培养技术的发展始于上世纪50年代，当时科学家们开始研究动物细胞的生长和繁殖机制，并尝试将其在培养基中进行体外培养。
然而，由于当时技术水平的限制，细胞培养的成活率和繁殖能力都较低，甚至无法维持长时间的培养。
随着科技水平的不断提高，人们逐渐解决了细胞培养过程中遇到的各种问题，开发出了更加成熟的动物细胞培养技术体系。
现在，动物细胞培养已经成为了现代生命科学领域的重要手段之一。
三、动物细胞培养技术的应用前景动物细胞培养技术具有广泛的研究和应用前景。
例如，在医学领域中，科学家们可以通过动物细胞培养技术研究癌症、病毒感染等疾病的治疗机制，并筛选出合适的治疗药物。
在生物技术领域中，动物细胞培养技术也被广泛应用于细胞克隆、蛋白质表达等方面。
此外，动物细胞培养技术还可以用于呼吸、毒性等方面的研究，并被广泛应用于化妆品、医疗器械、食品等商品的安全性评价。
总之，动物细胞培养技术作为生命科学中的一项重要技术，在未来的发展中将会发挥越来越重要的作用。
科学家们将继续在动物细胞培养技术的基础上，不断探索生命体内细胞和分子的奥秘，以期为人类的健康福祉做出更加卓越的贡献。
动物细胞培养基本技术
幻灯片1细胞培养基本技术幻灯片2细胞培养的甚本概念●传代：●细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。
●原代培养●取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
幻灯片3●细胞培养：使用单个细胞悬液●组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）●器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫幻灯片4原代培养细胞的生命归宿●原代培养期●传代期●衰退期幻灯片5幻灯片6●有限细胞系，无限细胞系●细胞系 cell line●细胞株 cell strain幻灯片7培养细胞的分类根据形态大致的不同，主要2类：上皮样成纤维细胞样其它，不定型幻灯片8上皮样细胞型名称：仅形态上似体内来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核幻灯片9生长特点易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状幻灯片10幻灯片11幻灯片12成纤维细胞样细胞名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核幻灯片13生长特点排列成放射状并不紧靠连成片，常有几个伸长的细胞突起幻灯片14幻灯片15培养细胞的特性●培养细胞的生长方式●贴附生长：●必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞●悬浮生长：●于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。
见于各种造血系统肿瘤细胞幻灯片16每代贴附生长细胞的生长过程●游离期●贴壁期●潜伏期●对数生长期●停止期（平台期）幻灯片17●游离期：●细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。
此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
● 10分钟一4小时幻灯片18●贴壁期：●细胞附着于底物上，游离期结束。
细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。
动物细胞培养技术及应用
动物细胞培养技术及应用动物细胞培养技术是指利用组织培养法将动物细胞放置于特定的环境中，用来进行增殖、分化、在体外环境下维持生长等过程的技术。
这一技术已经成为了现代细胞和分子生物学研究的重要手段。
本文将介绍动物细胞培养技术的基本原理及其应用。
一、动物细胞培养技术的基本原理在进行动物细胞培养前，需要准备好培养基和适当的培养条件。
培养基是将动物细胞培养在其周围的一种液体或半固体的培养物，它必须含有细胞所必需的营养成分，如氨基酸、脂类、葡萄糖、维生素等，以支持细胞的正常生长。
培养条件包括温度、pH值、氧气浓度、湿度、通风等各种环境因素，这些因素可以影响细胞的生长和分化。
具体培养方法分为悬浮培养法和附着培养法。
悬浮培养法是将细胞培养在含有培养基的培养瓶、组织培养皿等器皿中，通过轻微的旋转或震动来保持细胞的悬浮状态，利用悬浮液对细胞的营养和氧气的供应进行维持。
附着培养法则是将细胞种子层铺在贴壁培养皿、多孔性膜上等固体表面上，利用培养基中的营养成分来维持细胞的生长、分化和增殖。
二、动物细胞培养技术的应用1. 细胞和分子生物学研究细胞和分子生物学研究是动物细胞培养技术最重要的应用之一。
细胞培养可以提供包括人类肿瘤细胞、小鼠胚胎细胞等多种类型的细胞，用于生化、免疫学、遗传学、病理学等各方面的基础研究。
此外，细胞培养还可以用于DNA转染、蛋白质表达、细胞重编程、药物筛选等研究领域中。
2. 医学研究动物细胞培养技术在医学研究方面有着广泛的应用。
骨髓细胞移植、组织生长因子的使用、干细胞移植等同样都需要细胞培养技术的支持。
使用动物细胞培养技术可以帮助医学科研人员更好地理解许多疾病的形成原因，从而精准发现并创新医学治疗方案。
3. 疫苗的生产动物细胞培养技术还可以用于疫苗生产。
传统的疫苗生产技术主要是利用动物组织来进行培养材料生产。
这种方法存在很多的安全风险，同时还有可能感染人畜共患疾病。
相对而言，利用动物细胞培养技术制作疫苗有着更高效、更便捷、更安全的优势。
动物细胞培养技术的进展及应用
动物细胞培养技术的进展及应用动物细胞培养技术是一种生物医学研究中极为重要的技术，主要用于生产药品、细胞学、分子生物学和免疫学等领域的研究。
自从细胞培养技术的出现，它的应用范围越来越广泛，也越来越深入，本文将为您介绍动物细胞培养技术的进展及应用。
一、动物细胞培养技术的研究进展1. 细胞培养的基本原理细胞培养的基本原理是利用体外条件来模拟体内环境，为细胞提供适宜的营养物和生理调节因子，使细胞在体外生长、分化、增殖。
2. 培养基的制备培养基的制备是动物细胞培养技术中的关键步骤，它能够为细胞提供必需的营养物和生长因子，如氨基酸、维生素、激素等。
目前，常用培养基包括麦克尼五十五培养基、迈格林五十三号培养基等。
3. 细胞培养的技术方法细胞培养的技术方法主要有悬浮培养和附着培养两种方式。
其中，悬浮培养常用于细胞生长阶段的初步生长，主要是用于细胞的扩增；附着培养主要用于细胞的育种。
4. 细胞分离技术细胞分离技术将组织或器官中的细胞分离出来并对其进行分级培养。
常用的细胞分离技术主要包括胰酶、碎草酸和牛血清等。
5. 细胞传代技术细胞传代技术是指将已经生长到一定程度的细胞离心，将细胞培养上清液丢弃并重悬细胞，再一次培养出与上一代相同的数量和质量的细胞。
其目的是为了维持细胞的正常生理状态和扩大培养规模。
二、动物细胞培养技术的应用方向1. 生产药品细胞培养技术的重要应用之一就是生产药品。
细胞培养可以生产多种药品，如激素、抗体、血液制品等，与传统药品相比，细胞培养药品具有高纯度、低污染的优点。
2. 动物学研究细胞培养技术在动物学研究中也起着重要的作用。
细胞培养可以用于体外模拟动物器官的建立，从而研究生物功能和对病原体的免疫反应等。
3. 生物技术领域的应用细胞培养技术在生物技术领域也广泛应用。
例如细胞间相互作用的研究、生物反应器的建立、基因工程的研究等。
4. 医学领域的应用细胞培养技术在医学领域也有广泛的应用，如癌症的研究、干细胞和组织工程的应用等，这些领域都离不开细胞培养技术。
动物细胞培养原理
动物细胞培养原理
动物细胞培养是一种基于细胞生物学原理的实验技术，用于在体外环境中维持和增殖动物细胞。
其基本原理可以归结为以下几点：
1. 细胞培养基的准备：动物细胞培养基是一种含有营养物质、生长因子和激素的培养液。
它提供了细胞生长所需的基本养分和环境条件。
培养基的配方可以根据不同细胞类型的要求进行调整。
2. 细胞来源和分离：动物细胞通常来自活体组织或已经培养的细胞系。
活体组织需要进行分离，通过消化酶或机械切碎等方法将组织细胞单元分离开来。
3. 细胞接种和传代：分离得到的细胞被接种到含有培养基的培养皿中，放入培养箱内进行培养。
细胞根据其生长速度和密度定期传代，即将细胞从原培养皿中剥离并转移到新的培养皿中。
4. 培养环境的控制：细胞培养中，一系列环境因素需要得到严格控制，如温度、湿度、气体浓度和pH值等。
这些条件的维
持可以使用培养箱、CO2和空气混合器以及培养皿的设计来
实现。
5. 感染与检测：细胞培养过程中，存在着细菌、真菌、病毒等微生物的污染风险。
为了防止细胞感染，通常会添加抗生素或抗真菌剂到培养基中。
同时，也需要进行细胞的纯度和活性检测，如形态学观察、细胞计数、细胞周期的测定以及特定蛋白
质或基因的表达分析等。
总而言之，动物细胞培养是一项复杂而精细的技术，依靠培养基的配制、细胞来源和分离、细胞接种和传代、培养环境的控制以及感染与检测等步骤来实现。
这项技术的发展和应用对于细胞生物学、药物研发、组织工程等领域有着重要的意义。
动物细胞培养技术与应用
动物细胞培养技术与应用近年来，动物细胞培养技术越来越受到广泛关注和应用。
动物细胞培养技术能够提供一种高效、可重复、可控的生物制造平台，广泛应用于医药、生物科技、农业、食品和环境等领域。
本文将从基本原理、培养价值、应用领域等方面综述动物细胞培养技术的相关内容。
1.基本原理动物细胞培养技术是利用体外细胞培养技术使动物细胞在特定的培养基中繁殖和分化的过程。
在细胞培养中，必须提供足够的营养物质和适宜的环境条件，以维持细胞的正常生长、分裂和分化等生理功能，同时不断移除代谢废物，保持培养基内的成分和水平的动态平衡。
细胞培养的主要流程包括细胞的来源、细胞的分离、细胞的培养、细胞的检测和细胞的储存等环节。
2.培养价值细胞培养技术作为一种新型的生物制造系统，与传统的生物制造方法相比，有着明显的优势。
首先，细胞培养技术可以通过体外大规模培养已知功能和性状的细胞，实现单一和纯化产物的生产，避免了传统制备方法复杂、低效、昂贵等缺点。
其次，细胞培养技术还能使基因重组、修饰和表达更加方便和精准，避免了传统的生物试验与生产之间的差异。
最后，细胞培养技术还能提供量身定制的生物试验平台，用于研究动物细胞代谢、毒理学、病理学等方面的问题。
3.应用领域（1）制药业动物细胞培养技术已经成为现代制药业中生产重要药物的主要手段。
利用细胞培养技术可以制备大量高质量、高纯度的药物，避免了传统制备方法复杂、低效、成本高昂的情况。
细胞培养技术所得到的药物小分子毒性低、有效性高，已经成为现代药物开发的主要方向之一。
（2）生物医学研究细胞培养技术也是生物医学研究的重要手段之一。
利用细胞培养技术，可以研究细胞的生长、分化、代谢以及生理功能，有助于探索疾病形成的机制、评估新药的效果和安全性等问题。
（3）食品工业细胞培养技术可以使得肉类、奶制品和卵制品等食品的生产更加高效、环保、健康、可控，避免了动物残留药物、抗生素等问题。
同时，细胞培养技术还可以在最短时间内开发出一系列的新鲜和安全的食品产品，满足当前多样化、高品质的食品需求。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR方法
支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体, M.Fermentane ATCC19989发酵支原体 , M.Salivarium ATCC23064唾液 支原体 ,M.Hominis ATCC23114人型支原体 ,M.Orale ATCC23714口腔支 原体 ,M.Hyorhinis ATCC29052猪鼻支原体。 其共同引物序列来自16s和23s保守区域： 外部引物为： Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′， Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ3′； 内部引物为： Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′， Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。
【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿 着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工 作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始 操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物 品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗 手还要戴口罩、着消毒衣帽。
• 2．四唑盐（MTT）比色法
• •
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫 色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚 砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；
【培养前准备】
在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事 先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放
置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验
后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。
【操作野消毒】
无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)， 紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。 然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同 时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡 射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等 用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
细胞培养基本技术
ustcwhm@
无菌操作技术
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败
的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作 不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一 项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。
Terms to remember :
PCR方法
原理：
利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma
DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列， 由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制
之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
减少污染，减少细胞生物学特性变化。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
•
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
•
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞 器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形
消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant) 灭菌(sterilization)
防腐(antisepsis)和防腐剂
抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic) 无菌(asepsis) 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)
• 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
•
• 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 • 3．贴壁生长细胞传代
•
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
贴壁生长细胞传代方法：
• 1 吸光培养瓶中的培养液 • 2 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） • 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。
DNA荧光染色法
原理︰利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）检测支原体污染。此 染剂会结合到DNA之富含A-T区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～
80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与 细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体 之污染。 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养 液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T3 cell），然后培养指示细胞再作萤光染 色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有 些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不 易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。
成大冰晶，即冰晶的重结晶。
慢冻程序
• 标准程序：
•
• • •
当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min
当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
• 简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过 线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，
【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点 燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶 口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。
【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空 气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接 触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
•
MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放
射敏感性实验等。
• 操作步骤：
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培
养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ • CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；
（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3
培养细胞的观察
１．肉眼观察培养物颜色及混浊度 ２．倒置显微镜观察细胞生长状态
细胞计数
• 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进
行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法
与血细胞计数相同。 • 血细胞计数器：手工计数细胞 • Coulter计数仪：人工计数
• 3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
• 4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 • 5 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。 • 5 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 • 6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 • 7 将后者放入培养箱中培养。
培养细胞活力测定
PCR方法
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易 培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对 照组，避免可能之污染。 缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结 果仅作为参考和内部品管之一部份。
细胞复苏方法
（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；
（3）低速离心10分钟；
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
细胞培养的污染和检测
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术
不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。
的特征变化 ； 3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；
4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；
5.研究或操作人员忽略污染问题； 6.已受污染的细胞； 7.已受污染的培养基、血清。
支原体之检测：
相差显微镜观察法
Hayflick培养基直接培养法 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤 之标准步骤。 缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养 基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应 对照组，可能会造成污染。
细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计
数板之间。
3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和
上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算， 若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
细胞冻存方法
• 1．预先配制冻存液：含20%血清培养基，1伤害细胞； • 2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,
用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)；
• 3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和 冷冻日期。