动物细胞培养的基本技术
动物细胞培养基本技术精讲
潜伏期：
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞潜伏期一 般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
细胞的营养需要 细胞的生存环境
温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒
再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一 2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打 法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
细胞培养基本技术
杂交瘤细胞融合技术
合成培养基： Dulbecco's Modified Eagle's Medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium Medium 199 Earle's Minimum Essential Medium Nutrient Mixture F-10 Ham's Nutrient Mixture F-12 Ham's RPMI-1640 Medium KSOM、CZB、M16、MTF、SOF
结果的分析；易发生支原体污染。
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法 模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和 其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
动物细胞培养的方法
动物细胞培养的方法
动物细胞培养是一种在实验室中进行的细胞生物学技术，可以用来研究细胞的生长、分化、代谢以及毒性等方面。
一般来说，动物细胞培养需要以下步骤：
1. 选择细胞系：选择适合自己研究的细胞系，例如常用的HeLa 细胞、293细胞等。
2. 培养基配制：根据细胞系的需求配制适当的培养基，添加必要的营养物质和能量补给。
3. 细胞分离：用消化酶将组织细胞分离成单个细胞，避免细胞间黏连。
4. 细胞传代：当细胞密度达到一定量级后，需要将细胞传到新的培养皿中，以保证细胞的生长和繁殖。
5. 细胞存储：将细胞冷冻保存以备日后使用。
以上是动物细胞培养的基本步骤，当然在实际应用中还涉及到一些技术细节和技巧，需要不断摸索和实践。
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动物细胞培养技术的发展
动物细胞培养技术的发展随着现代科技的不断发展，动物细胞培养技术正在逐步成为生命科学领域的重要研究手段。
动物细胞培养技术可以使科研人员对生命体内的细胞和分子进行深入的研究，从而更好地理解细胞和生命活动的本质。
本文将简要介绍动物细胞培养技术的基本原理、发展历程以及应用前景。
一、动物细胞培养技术的基本原理动物细胞培养技术是一种将分离的动物细胞放入培养基中，使其在适宜的环境下进行生长和繁殖的技术。
通常情况下，细胞培养基中会添加生长因子、营养物质、激素等物质，以保证细胞的正常生长和分裂。
在培养期间，科研人员可以通过各种手段对细胞进行操控、观察和分析，以获得有关生命体内各种细胞和分子的重要信息。
二、动物细胞培养技术的发展历程动物细胞培养技术的发展始于上世纪50年代，当时科学家们开始研究动物细胞的生长和繁殖机制，并尝试将其在培养基中进行体外培养。
然而，由于当时技术水平的限制，细胞培养的成活率和繁殖能力都较低，甚至无法维持长时间的培养。
随着科技水平的不断提高，人们逐渐解决了细胞培养过程中遇到的各种问题，开发出了更加成熟的动物细胞培养技术体系。
现在，动物细胞培养已经成为了现代生命科学领域的重要手段之一。
三、动物细胞培养技术的应用前景动物细胞培养技术具有广泛的研究和应用前景。
例如，在医学领域中，科学家们可以通过动物细胞培养技术研究癌症、病毒感染等疾病的治疗机制，并筛选出合适的治疗药物。
在生物技术领域中，动物细胞培养技术也被广泛应用于细胞克隆、蛋白质表达等方面。
此外，动物细胞培养技术还可以用于呼吸、毒性等方面的研究，并被广泛应用于化妆品、医疗器械、食品等商品的安全性评价。
总之，动物细胞培养技术作为生命科学中的一项重要技术，在未来的发展中将会发挥越来越重要的作用。
科学家们将继续在动物细胞培养技术的基础上，不断探索生命体内细胞和分子的奥秘，以期为人类的健康福祉做出更加卓越的贡献。
动物细胞培养基本技术
幻灯片1细胞培养基本技术幻灯片2细胞培养的甚本概念●传代：●细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。
●原代培养●取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
幻灯片3●细胞培养：使用单个细胞悬液●组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）●器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫幻灯片4原代培养细胞的生命归宿●原代培养期●传代期●衰退期幻灯片5幻灯片6●有限细胞系，无限细胞系●细胞系 cell line●细胞株 cell strain幻灯片7培养细胞的分类根据形态大致的不同，主要2类：上皮样成纤维细胞样其它，不定型幻灯片8上皮样细胞型名称：仅形态上似体内来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核幻灯片9生长特点易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状幻灯片10幻灯片11幻灯片12成纤维细胞样细胞名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核幻灯片13生长特点排列成放射状并不紧靠连成片，常有几个伸长的细胞突起幻灯片14幻灯片15培养细胞的特性●培养细胞的生长方式●贴附生长：●必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞●悬浮生长：●于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。
见于各种造血系统肿瘤细胞幻灯片16每代贴附生长细胞的生长过程●游离期●贴壁期●潜伏期●对数生长期●停止期（平台期）幻灯片17●游离期：●细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。
此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
● 10分钟一4小时幻灯片18●贴壁期：●细胞附着于底物上，游离期结束。
细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。
动物细胞培养技术及应用
动物细胞培养技术及应用动物细胞培养技术是指利用组织培养法将动物细胞放置于特定的环境中，用来进行增殖、分化、在体外环境下维持生长等过程的技术。
这一技术已经成为了现代细胞和分子生物学研究的重要手段。
本文将介绍动物细胞培养技术的基本原理及其应用。
一、动物细胞培养技术的基本原理在进行动物细胞培养前，需要准备好培养基和适当的培养条件。
培养基是将动物细胞培养在其周围的一种液体或半固体的培养物，它必须含有细胞所必需的营养成分，如氨基酸、脂类、葡萄糖、维生素等，以支持细胞的正常生长。
培养条件包括温度、pH值、氧气浓度、湿度、通风等各种环境因素，这些因素可以影响细胞的生长和分化。
具体培养方法分为悬浮培养法和附着培养法。
悬浮培养法是将细胞培养在含有培养基的培养瓶、组织培养皿等器皿中，通过轻微的旋转或震动来保持细胞的悬浮状态，利用悬浮液对细胞的营养和氧气的供应进行维持。
附着培养法则是将细胞种子层铺在贴壁培养皿、多孔性膜上等固体表面上，利用培养基中的营养成分来维持细胞的生长、分化和增殖。
二、动物细胞培养技术的应用1. 细胞和分子生物学研究细胞和分子生物学研究是动物细胞培养技术最重要的应用之一。
细胞培养可以提供包括人类肿瘤细胞、小鼠胚胎细胞等多种类型的细胞，用于生化、免疫学、遗传学、病理学等各方面的基础研究。
此外，细胞培养还可以用于DNA转染、蛋白质表达、细胞重编程、药物筛选等研究领域中。
2. 医学研究动物细胞培养技术在医学研究方面有着广泛的应用。
骨髓细胞移植、组织生长因子的使用、干细胞移植等同样都需要细胞培养技术的支持。
使用动物细胞培养技术可以帮助医学科研人员更好地理解许多疾病的形成原因，从而精准发现并创新医学治疗方案。
3. 疫苗的生产动物细胞培养技术还可以用于疫苗生产。
传统的疫苗生产技术主要是利用动物组织来进行培养材料生产。
这种方法存在很多的安全风险，同时还有可能感染人畜共患疾病。
相对而言，利用动物细胞培养技术制作疫苗有着更高效、更便捷、更安全的优势。
动物细胞培养技术的进展及应用
动物细胞培养技术的进展及应用动物细胞培养技术是一种生物医学研究中极为重要的技术，主要用于生产药品、细胞学、分子生物学和免疫学等领域的研究。
自从细胞培养技术的出现，它的应用范围越来越广泛，也越来越深入，本文将为您介绍动物细胞培养技术的进展及应用。
一、动物细胞培养技术的研究进展1. 细胞培养的基本原理细胞培养的基本原理是利用体外条件来模拟体内环境，为细胞提供适宜的营养物和生理调节因子，使细胞在体外生长、分化、增殖。
2. 培养基的制备培养基的制备是动物细胞培养技术中的关键步骤，它能够为细胞提供必需的营养物和生长因子，如氨基酸、维生素、激素等。
目前，常用培养基包括麦克尼五十五培养基、迈格林五十三号培养基等。
3. 细胞培养的技术方法细胞培养的技术方法主要有悬浮培养和附着培养两种方式。
其中，悬浮培养常用于细胞生长阶段的初步生长，主要是用于细胞的扩增；附着培养主要用于细胞的育种。
4. 细胞分离技术细胞分离技术将组织或器官中的细胞分离出来并对其进行分级培养。
常用的细胞分离技术主要包括胰酶、碎草酸和牛血清等。
5. 细胞传代技术细胞传代技术是指将已经生长到一定程度的细胞离心，将细胞培养上清液丢弃并重悬细胞，再一次培养出与上一代相同的数量和质量的细胞。
其目的是为了维持细胞的正常生理状态和扩大培养规模。
二、动物细胞培养技术的应用方向1. 生产药品细胞培养技术的重要应用之一就是生产药品。
细胞培养可以生产多种药品，如激素、抗体、血液制品等，与传统药品相比，细胞培养药品具有高纯度、低污染的优点。
2. 动物学研究细胞培养技术在动物学研究中也起着重要的作用。
细胞培养可以用于体外模拟动物器官的建立，从而研究生物功能和对病原体的免疫反应等。
3. 生物技术领域的应用细胞培养技术在生物技术领域也广泛应用。
例如细胞间相互作用的研究、生物反应器的建立、基因工程的研究等。
4. 医学领域的应用细胞培养技术在医学领域也有广泛的应用，如癌症的研究、干细胞和组织工程的应用等，这些领域都离不开细胞培养技术。
动物细胞培养原理
动物细胞培养原理
动物细胞培养是一种基于细胞生物学原理的实验技术，用于在体外环境中维持和增殖动物细胞。
其基本原理可以归结为以下几点：
1. 细胞培养基的准备：动物细胞培养基是一种含有营养物质、生长因子和激素的培养液。
它提供了细胞生长所需的基本养分和环境条件。
培养基的配方可以根据不同细胞类型的要求进行调整。
2. 细胞来源和分离：动物细胞通常来自活体组织或已经培养的细胞系。
活体组织需要进行分离，通过消化酶或机械切碎等方法将组织细胞单元分离开来。
3. 细胞接种和传代：分离得到的细胞被接种到含有培养基的培养皿中，放入培养箱内进行培养。
细胞根据其生长速度和密度定期传代，即将细胞从原培养皿中剥离并转移到新的培养皿中。
4. 培养环境的控制：细胞培养中，一系列环境因素需要得到严格控制，如温度、湿度、气体浓度和pH值等。
这些条件的维
持可以使用培养箱、CO2和空气混合器以及培养皿的设计来
实现。
5. 感染与检测：细胞培养过程中，存在着细菌、真菌、病毒等微生物的污染风险。
为了防止细胞感染，通常会添加抗生素或抗真菌剂到培养基中。
同时，也需要进行细胞的纯度和活性检测，如形态学观察、细胞计数、细胞周期的测定以及特定蛋白
质或基因的表达分析等。
总而言之，动物细胞培养是一项复杂而精细的技术，依靠培养基的配制、细胞来源和分离、细胞接种和传代、培养环境的控制以及感染与检测等步骤来实现。
这项技术的发展和应用对于细胞生物学、药物研发、组织工程等领域有着重要的意义。
动物细胞培养技术与应用
动物细胞培养技术与应用近年来，动物细胞培养技术越来越受到广泛关注和应用。
动物细胞培养技术能够提供一种高效、可重复、可控的生物制造平台，广泛应用于医药、生物科技、农业、食品和环境等领域。
本文将从基本原理、培养价值、应用领域等方面综述动物细胞培养技术的相关内容。
1.基本原理动物细胞培养技术是利用体外细胞培养技术使动物细胞在特定的培养基中繁殖和分化的过程。
在细胞培养中，必须提供足够的营养物质和适宜的环境条件，以维持细胞的正常生长、分裂和分化等生理功能，同时不断移除代谢废物，保持培养基内的成分和水平的动态平衡。
细胞培养的主要流程包括细胞的来源、细胞的分离、细胞的培养、细胞的检测和细胞的储存等环节。
2.培养价值细胞培养技术作为一种新型的生物制造系统，与传统的生物制造方法相比，有着明显的优势。
首先，细胞培养技术可以通过体外大规模培养已知功能和性状的细胞，实现单一和纯化产物的生产，避免了传统制备方法复杂、低效、昂贵等缺点。
其次，细胞培养技术还能使基因重组、修饰和表达更加方便和精准，避免了传统的生物试验与生产之间的差异。
最后，细胞培养技术还能提供量身定制的生物试验平台，用于研究动物细胞代谢、毒理学、病理学等方面的问题。
3.应用领域（1）制药业动物细胞培养技术已经成为现代制药业中生产重要药物的主要手段。
利用细胞培养技术可以制备大量高质量、高纯度的药物，避免了传统制备方法复杂、低效、成本高昂的情况。
细胞培养技术所得到的药物小分子毒性低、有效性高，已经成为现代药物开发的主要方向之一。
（2）生物医学研究细胞培养技术也是生物医学研究的重要手段之一。
利用细胞培养技术，可以研究细胞的生长、分化、代谢以及生理功能，有助于探索疾病形成的机制、评估新药的效果和安全性等问题。
（3）食品工业细胞培养技术可以使得肉类、奶制品和卵制品等食品的生产更加高效、环保、健康、可控，避免了动物残留药物、抗生素等问题。
同时，细胞培养技术还可以在最短时间内开发出一系列的新鲜和安全的食品产品，满足当前多样化、高品质的食品需求。
.动物细胞培养技术
动物细胞培养技术绪论部分1）细胞的基本概念：细胞（包括单个个体）在体外条件下的生长，成为细胞培养。
2）组织培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌，适当温度和一定营养条件下使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
（组织培养从广义上说分为动物组织营养和植物组织营养两大类。
）组织培养常用术语贴壁依赖性：为细胞需贴附于第五或支撑物上才能生长的性质。
细胞一代时间：单个细胞连续两次分裂的时间相隔，可借助显微电影照相术来精确确定。
群体倍增时间：在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需时间。
克隆;单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。
原代培养：从体内取出细胞或组织的第一次培养。
传代或传代培养：不论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。
细胞杂交：两个或多个不同的细胞融合导致一个含核体的形成。
细胞培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
细胞培养的作用：在病毒学上的作用（病毒的分离细胞培养在药物学上的作用（新药的制备、药效的鉴别、病毒疫苗的生产、单抗的制备）；细胞培养在肿瘤学研究上的作用（例如化疗中的药物使用剂量、癌症研究等）细胞培养在细胞功能与分化研究中的应用；细胞培养在免疫学中的应用1)Harrison首先解剖出蛙胚原始脊髓节段进行培养。
哈里森悬滴培养法。
建立起一套合理的无菌操作技术。
（淋巴）一般皆公认Harrison为“组织培养之父”，凹玻片悬滴制备培养技术，对生物学知识的研究做出十分重要贡献。
2) Carrel 反复传代的方法使细胞系存活34年。
他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶，Carrel flask)等都是对组织培养的重要贡献。
特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。
30年代传入我国，50年代逐渐发展细胞培养设施和基本条件（一）细胞实验室基本原则：防止微生物污染和有害物的影响。
《动物细胞培养技术及其应用》 知识清单
《动物细胞培养技术及其应用》知识清单一、动物细胞培养技术的基本概念动物细胞培养是指从动物体内取出细胞或者组织，在体外模拟体内的生理环境，使其生长、分裂、分化并维持其功能的一种技术。
这一技术为生物学、医学等领域的研究和应用提供了重要的手段。
二、动物细胞培养的基本条件1、无菌环境细胞培养必须在严格的无菌条件下进行，以防止微生物的污染。
这包括对培养器皿、培养基、操作工具等进行灭菌处理，以及在无菌操作箱中进行细胞的接种、传代等操作。
2、合适的培养基培养基为细胞提供了生长所需的营养物质，包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等。
此外，培养基中还常常添加血清，血清中含有多种生长因子和激素，有助于细胞的生长和增殖。
3、适宜的温度和 pH一般来说，动物细胞培养的温度通常在 37℃左右，pH 则在 72 74 之间。
保持稳定的温度和 pH 对于细胞的正常代谢和生长至关重要。
4、气体环境细胞培养需要一定的气体环境，通常是 95%的空气和 5%的二氧化碳。
二氧化碳可以调节培养基的 pH 值。
三、动物细胞培养的基本流程1、取材从动物体内取出所需的组织或细胞，例如通过手术获取肿瘤组织、从血液中分离白细胞等。
2、原代培养将取出的组织或细胞进行处理，使其分散成单个细胞，然后接种到培养器皿中，这就是原代培养。
在原代培养中，细胞会经历一个适应体外环境的过程。
3、传代培养当原代培养的细胞生长到一定密度时，需要将其分成若干份，重新接种到新的培养器皿中继续培养，这就是传代培养。
传代培养可以使细胞不断增殖。
4、细胞冻存与复苏为了长期保存细胞，可以将细胞在液氮中冻存。
当需要使用时，再将其复苏，使其恢复生长和代谢能力。
四、动物细胞培养技术的应用1、生物制品的生产利用动物细胞培养技术可以生产多种生物制品，如疫苗、抗体、蛋白质药物等。
例如，通过培养骨髓瘤细胞来生产单克隆抗体，用于疾病的诊断和治疗。
2、医学研究在医学领域，动物细胞培养技术为疾病的发病机制研究、药物筛选和药效评价提供了重要的实验模型。
动物细胞培养 基本技术和特殊应用指南
动物细胞培养基本技术和特殊应用指南Animal cell culture is a basic technique widely used in biological research and medical applications. 动物细胞培养是一种广泛应用于生物研究和医学应用中的基础技术。
It involves growing cells in a controlled environment outside of the body, allowing researchers to study cell behavior, test new drugs, and create strategies for disease treatment. 这涉及在体外受控环境中培养细胞，使研究人员能够研究细胞行为，测试新药物，并制定治疗疾病的策略。
One of the key components in animal cell culture is the culture medium, which provides essential nutrients and growth factors necessary for cell survival and proliferation. 动物细胞培养中的关键组成部分之一是培养基，它提供了细胞生存和增殖所必需的重要营养物质和生长因子。
The culture medium must be carefully formulated to mimic the conditions found in the body to ensure optimal cell growth and function. 培养基必须经过精心配制，以模拟体内的条件，以确保细胞的最佳生长和功能。
In addition to nutrients, the culture medium also contains buffering agents to maintain the pH level, antibiotics to prevent contamination, and other additives to support specific celltypes. 除了营养物质，培养基还含有缓冲剂以维持pH水平，抗生素以防止污染，以及其他添加剂以支持特定细胞类型。
《动物细胞培养技术》课件
动物细胞培养技术可以用于组织工程和再 生医学领域，为损伤或病变的组织和器官 提供替代疗法。
02
动物细胞培养的基本原理
细胞周期与细胞分裂
细胞周期
描述细胞生长和分裂的阶段，包 括间期和分裂期。
细胞分裂
细胞繁殖的方式，包括有丝分裂和 减数分裂。
细胞分裂调控
介绍细胞分裂的调控机制，如周期 蛋白、激酶等。
调整细胞浓度
将分离出的单个细胞调整到合适的浓度。
接种
将调整好的细胞悬液接种到培养容器中，轻轻晃 动容器使细胞均匀分布。
培养
将接种好的容器放置在恒温、恒湿、恒光的培养 箱中培养，定期观察记录细胞的生长情况。
细胞观察与检测
01
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形态观察
定期观察细胞的形态变化，如 细胞大小、形态、染色深浅等
。
• 干细胞治疗是一种新兴的治疗方法，利用干细胞的再生和分化能力来修复或替换受损的组织和器官。动物细胞培养技术在 干细胞治疗领域的应用，为干细胞分离、培养和扩增提供了重要的技术支持，有助于推动干细胞治疗的发展。
动物细胞培养技术的发展前景 干细胞治疗领域的应用
药物筛选与毒性测试
药物研发过程中，需要进行大量的药物筛选和毒性测试。动物细胞培养技术可以 模拟人体细胞对药物的反应，为药物筛选和毒性测试提供更为准确和可靠的数据 支持，有助于加速新药的研发进程。
动物细胞培养技术广泛应用于生物医 学、药物研发、食品安全等领域。
培养基是动物细胞培养的关键因素， 它为细胞提供营养、生长因子和适宜 的生存环境。
动物细胞培养技术的外培养动物细胞。
20世纪初，随着组织培养技术 的不断发展，动物细胞培养技术
逐渐成熟。
21世纪初，随着基因编辑技术 的发展，动物细胞培养技术在疾 病治疗、药物研发等领域的应用
动物细胞培养基本技术与原理备课讲稿
二、动物细胞特性
动物细胞在活体内的特性 培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性
1. 动物细胞在活体内的特性
在活体内，动物细胞:
增殖 分化
分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有 明显的形态学特征。
如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。
二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion )
（一）取材——获取组织
原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；
“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年 龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚 成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则 不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维 细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超 过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是 发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久 细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细 胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。
用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。
2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation)
第四章 动物细胞培养的基本技术和方法
境
二、细胞传代方法
1.贴壁细胞的消化法传代：
（1）吸弃或者倒掉瓶内陈旧的培养液
（2）于培养瓶内加入适量消化液 （3）消化2-5min，在显微镜下观察细胞状态，发现细胞质回缩，细胞间隙 增大后，应即刻停止消化 （4）吸除或者倒掉消化液 （5）吸管吸取新鲜培养液，按照顺序吹打瓶壁细胞，注意动作要轻柔 （6）计数后，按要求的接种量接种在新的培养基内
结果分析：
（1）作图法 （2）公式法
三、细胞培养的污染检测及排除
培养细胞的污染包括：微生物、化学物质、细胞交叉
1.微生物污染
污染途径：空气、器材、操作、血清、组织样本 污染对细胞的影响：抑制细胞生长，产生有毒物质，促使细胞死亡 微生物污染的检测与排除： （1）真菌污染 培养液中有白色或者浅黄色的漂浮物，细胞间有丝状菌丝体，可以采用霉菌素或者酮康唑对细 胞进行处理 （2）细菌污染 培养液短期颜色变黄、变浑浊，使用5-10倍抗生素剂量冲击法 （3）支原体感染 相差显微镜检测；荧光染色法；电镜检查；DNA分子杂交检查
2.悬浮细胞的传代方法：
（1）直接传代法 （2）离心传代法
三、细胞系的维持
细胞系的维持是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现的 注意事项： （1）做好细胞系的档案记录工作
（2）遵从细胞生长规律
（3）防止细胞间的交叉污冻存、复苏和运输技术
一、细胞的冻存
第四节 动物细胞传代培养技术
一、原代培养的首次传代
传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程 首次传代注意事项： （1）待细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面后再传代 （2）传代时候不同细胞需要消化的时间不同，要根据需要具体观察，
及时进行处理
（3）首次传代时，细胞接数量要多一些，促使细胞尽快适应生长环
动物细胞培养的基本技术
使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机 ，然后进行操作。使用后用75％的酒精擦洗台面。 切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。
恒温培养箱
变通电热恒温培养箱 CO2培养箱
细胞培养总原则
1
2 3 4
无菌无毒害的环境 支持生长增殖的营养 其它类似体内的环境
维持细胞性状
(一) 细胞培养无菌无毒环境
实验室设计合理 常用设施及设备 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的 材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中 性硬度玻璃制品。
细胞培养无菌操作基本技术
工作环境及表面的处理 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 培养液与培养细胞的处理
单蒸水冲洗3次
121℃高压蒸汽灭菌20min
塑料器材
常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、 12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸 头。 重复使用的处理步骤： 自来水刷洗 3％HCl或2％NaOH溶液浸泡过夜 双蒸水冲洗3次
自来水充分冲洗
紫外线直接照射或辐照灭菌
橡皮器材
首次使用： 自来水刷洗 5％ NaOH溶液煮沸15min 4％HCl盐酸煮沸15min 单蒸水冲洗3次 自来水冲洗8次
37℃，饱和湿度，5％CO2
其他设备
酶标仪
二、细胞培养常用器材及处理方法
玻璃器材 塑料器材 橡皮器材 金属器材 其他用品
玻璃器材
常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管。 首次使用：
自来水刷洗 0.1％稀盐酸浸泡过夜 自来水冲洗
重复使用的处理步骤：
自来水刷洗 硫酸－重铬酸钾浸泡过夜 双蒸水冲洗2次 自来水冲洗10次 晾干、包装
动物细胞培养
（2）消化分离法
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用 生化和化学手段进一步分散组织的方法。 1）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、 羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。 2）胶原酶（Collagenase）消化法： 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的消化 作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。上皮 细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的 消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果 甚好。
移液器
离心机
酶标仪
微孔板震荡器
液氮罐
（二）动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度: 37 ℃
2、pH：最适为7.2～7.4
3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。
（1）血清：
主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、
每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：
1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基 性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。
动物细胞体外培养
Animal cells cultured in vitro
一、基本概念
动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外 模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一 定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结 构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、 组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、
动物细胞培养 基本技术和特殊应用指南
动物细胞培养就像细胞的VIP温泉——这是它们去的地方，以获得它
们生长和繁荣所需的一切爱和关注！和我们一样，细胞需要适当的环
境来生长，所以我们仔细地将它们与动物组织隔离起来，并在它们的培养介质中提供完美的营养和生长因素的鸡尾酒。
这就像为我们的小
蜂窝朋友创建豪华度假胜地！但不要忘记最重要的部分—所有的事
情都要保持干净和无菌，就像一个豪华的酒店。
我们必须精确地处
理一切，以确保细胞保持快乐和健康。
这有点像一个细胞低语者—
你必须了解他们的需要并满足他们，以确保他们保持顶级状态。
在动物细胞文化的世界里，这一切都是为了为我们的小客人创造一个完美的天堂，确保他们拥有所有他们需要的繁荣。
动物细胞培养不仅仅是基本的实验—它有各种酷的用途！它被用于
制造疫苗，抗体，以及治疗蛋白。
科学家也利用它来研究毒素，测试
新药，甚至培养替代药物的组织。
有一些特殊的技巧，比如使用无血
清培养或生长细胞在细小的珠子上，都是专家为这些特定的工作开发
出来的。
但是这些奇特的技巧和技巧需要很多的技巧和技巧
动物细胞培养是一种具有高度多功能性和影响力的技术，具有各种各
样的应用。
这需要对执行具体应用的基本方法和专门知识进行全面的
了解。
通过细胞培养技术的发展，动物细胞培养在研究，生物技术，
医学领域的潜力不断扩大，成为动物细胞检查和实施不可或缺的工具。
动物细胞培养技术
第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
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PCR方法
支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体, M.Fermentane ATCC19989发酵支原体 , M.Salivarium ATCC23064唾液 支原体 ,M.Hominis ATCC23114人型支原体 ,M.Orale ATCC23714口腔支 原体 ,M.Hyorhinis ATCC29052猪鼻支原体。 其共同引物序列来自16s和23s保守区域： 外部引物为： Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′， Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ3′； 内部引物为： Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′， Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。
【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿 着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工 作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始 操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物 品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗 手还要戴口罩、着消毒衣帽。
• 2．四唑盐（MTT）比色法
• •
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫 色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚 砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；
【培养前准备】
在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事 先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放
置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验
后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。
【操作野消毒】
无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)， 紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。 然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同 时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡 射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等 用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
细胞培养基本技术
ustcwhm@
无菌操作技术
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败
的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作 不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一 项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。
Terms to remember :
PCR方法
原理：
利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma
DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列， 由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制
之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
减少污染，减少细胞生物学特性变化。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
•
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
•
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞 器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形
消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant) 灭菌(sterilization)
防腐(antisepsis)和防腐剂
抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic) 无菌(asepsis) 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)
• 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
•
• 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 • 3．贴壁生长细胞传代
•
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
贴壁生长细胞传代方法：
• 1 吸光培养瓶中的培养液 • 2 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） • 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。
DNA荧光染色法
原理︰利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）检测支原体污染。此 染剂会结合到DNA之富含A-T区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～
80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与 细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体 之污染。 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养 液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T3 cell），然后培养指示细胞再作萤光染 色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有 些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不 易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。
成大冰晶，即冰晶的重结晶。
慢冻程序
• 标准程序：
•
• • •
当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min
当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
• 简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过 线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，
【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点 燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶 口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。
【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空 气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接 触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
•
MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放
射敏感性实验等。
• 操作步骤：
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培
养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ • CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；
（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3
培养细胞的观察
１．肉眼观察培养物颜色及混浊度 ２．倒置显微镜观察细胞生长状态
细胞计数
• 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进
行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法
与血细胞计数相同。 • 血细胞计数器：手工计数细胞 • Coulter计数仪：人工计数
• 3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
• 4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 • 5 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。 • 5 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 • 6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 • 7 将后者放入培养箱中培养。
培养细胞活力测定
PCR方法
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易 培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对 照组，避免可能之污染。 缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结 果仅作为参考和内部品管之一部份。
细胞复苏方法
（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；
（3）低速离心10分钟；
（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
细胞培养的污染和检测
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术
不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。
的特征变化 ； 3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；
4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；
5.研究或操作人员忽略污染问题； 6.已受污染的细胞； 7.已受污染的培养基、血清。
支原体之检测：
相差显微镜观察法
Hayflick培养基直接培养法 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤 之标准步骤。 缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养 基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应 对照组，可能会造成污染。
细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计
数板之间。
3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和
上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算， 若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
细胞冻存方法
• 1．预先配制冻存液：含20%血清培养基，1伤害细胞； • 2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,
用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)；
• 3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和 冷冻日期。