浅谈动物组织器官培养

浅谈动物组织器官培养

（一）前言

1954年，人类进行了第一例器官移植手术。那时人们面对着非常多挑战，就像现在的今天一样，虽然在医疗、科技等方面我们取得了巨大进步，拯救了很多生命，但我们却非常缺乏器官，在过去十年，等待移植的病人数量已经翻倍，但与此同时，移植的数量却基本不变，这主要因为我们老龄化的人口，我们正在变老，医疗效果变好了，使我们能活得更长，但随着我们变老，器官也越来越容易生病，所以这是一个挑战，对于器官、组织都是如此。一个数据显示，地球上每30秒钟，就有一个病人死于可用替换组织治疗的疾病，所以通过体外培养的组织器官，实验寻找支持和维持及激活再生潜能细胞的所需生命物质，而后再将这些生命物质送到人体原位的组织器官中，促使原位的再生潜能细胞增殖，形成新的组织器官增补或代替原来损伤的或缺损的细胞及组织器官，及时恢复器官的功能，达到自行医疗疾病和预防疾病就显得至关重要。

（二）介绍

动物细胞培养定义

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。

器官培养的定义

从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外的一定的环境中培养。

主要强调器官组织的相对完整性。

⑴组织厚度和直径＜1mm，使之能靠自然渗透来维持氧气和营养。

⑵保证内部细胞有足够的氧气渗入，可以提高氧分压或加注纯氧。

⑶附加特殊的培养基如生长因子，激素

一、培养细胞的生存环境

1.环境无毒和无菌

2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。

3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.4 。

4.渗透压；260－320mOsm/kg适用于大多数细胞。

5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等。

二、动物细胞培养的特殊性

1、大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。

2、动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。

3、对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。

4、动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。

三、常用的培养方法

（1）悬滴培养法

是最早建立的体外培养技术，是组织、器官培养的经典方法，最早是由Harrison 于1907年创立的。

基本要点是：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片之上，最后用熔蜡密封后放入培养箱中培养。

单玻片的再培养

1）用消毒剃须刀刮去盖玻片四周的石蜡

2）用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿内。

3）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。

4）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。

（2）培养瓶培养法

将拟培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。凡是可以用于培养生物结构的瓶子都可称为培养瓶。

（3）旋转管培养法

将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上，旋转培养的一种方法。

（4）灌注小室培养法

将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出。最初是1912年由Burrows尝试设计了一种简单的灌注小室培养模型。

（5）培养板培养法

具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。

四、器官培养的方法

１、表玻璃器官培养法

表玻璃器官培养法是由Fell和Robinson于1929年建立的一种器官培养的经典技术。技术要点是：在一块表玻璃内加上鸡胚提取液和鸡血浆，凝固后将所培养的器官移植到上面，然后一起置于一培养皿内，送入培养箱内培养。

２、琼脂凝胶培养法

与血凝块比较，琼脂固体培养基的优点在于基质不液化，细胞在琼脂上的迁移受到限制。 Wolff和Schneider采用改良后的琼脂培养基成功进行了胚胎器官的发育及形态发生的研究，后来又利用琼脂凝胶培养基进行了肿瘤组织的培养。由此而设计了Wolff器官培养法。

３、擦镜纸培养法

Chen发现擦镜纸具有疏水性，可以漂浮在培养液表面作为培养器官的支持物，同时，培养液可以透过擦镜纸而进入培养器官的内部，从而设计了擦镜纸培养法，这是最早的在气——液表面进行器官培养的方法。需注意的是，在将植块放于擦镜纸上面时要尽量小心，以免下沉。

４、金属格栅器官培养法

由于漂浮支持物很难长久地漂浮于培养液表面，需要用坚硬的支持物替代。1954年Trowell创立了金属格栅器官培养法。金属格栅要采用坚实的网格，保证平稳、安全地支托或移动大量的培养器官，而且必须平坦且与培养液平行。

５、琼脂小岛器官培养法

使用琼脂制成小岛状的支持物，放在液体培养基中，然后将要培养的器官置于琼脂上面进行培养。琼脂不但具有支持作用，而且还可防止培养器官的细胞发生迁移。这种方法可以在培养过程中直接观察植块的生长状况，而且，既具有琼脂凝胶培养法能维持器官较长时间在体外生长、抑制细胞迁移的优点，又具有采用液体培养基换液简便的特点。此外，固相和液相培养基共存，从而可在同一培养体系中加入不同的营养成分，使在同一培养系统中培养不同的器官成为可能。６、陈氏滤纸虹吸器官培养法

陈瑞铭1964年发明的。在一标本缸内放置一玻璃制成的架子，架子上放置一玻璃船，船内装培养液，船边悬挂滤纸。缸盖是一张带三个孔的玻璃板，两侧的孔供气体进出，中间的孔用作向玻璃船内灌注培养液。器官可以贴在滤纸上进行培养，营养的供应主要靠滤纸的虹吸作用。优点是可持续地、适量地获得营养、一个支持面可以同时培养较多的植块、能随时收集培养液或植块进行分析、观察。７、灌流式器官培养方法

很多种培养方法都需要经常更换培养液，而且还不能保持器官生存环境的稳定。操作麻烦、易被污染，而且也不利用对代谢过程进行研究。 1938年，carrel 和Lindberg尝试了采用无菌循环装置培养猫的甲状腺，并维持了数星期。他们用泵将营养液泵入器官内，并经过器官循环后流出，这是最早的灌注式培养器官。（三）当代动物组织器官培养的研究成就

1、破解了人体生命延续之谜——“人类的生命延续是人体组织器官中的潜能再生细胞，及时不断地增殖补充已凋亡、退化、损伤坏死的组织细胞，以维持其组织架构和功能来实现的；人类组织器官中的再生潜能细胞，是在组织器官发育形成的各个时期，由原始和多能干细胞增殖时产生的。这些细胞以普通细胞形式参与组织器官的架构和功能形成，与增殖的干细胞形成的组织共同组合成器官。当组织器官的细胞凋亡、退化、损伤坏死时，这些潜能细胞原位启动自身增殖的功能，再生复制新的细胞，来及时补充器官中的细胞、组织、功能空缺，从而及时恢复器官的结构和功能，保障器官组织功能的持续，人体所有器官的这项功能发挥正常，人体就能维持整体生命的平衡，实现其健康长寿；如果某一器官或组织的这一功能不能发挥或低下，某器官或组织就会产生疾病。这就是人类生命的奥秘”。

2、临床实现了皮肤大器官和胃肠粘膜器官的原位复制，原位复制器官的生命物质产品已广泛地投入国际国内市场。

3、体外用原位潜能再生细胞培养出毛囊、骨髓、胰腺、肾小球肾小管、心肌、神经等55个“组织器官”。

4、已完成了21个组织器官的生命物质研究，正在进行原位器官功能实验。（四）科学及医学和经济价值

1、破解了人体生命延续之谜，找到了人体组织器官及功能延续的源头--再生潜能细胞；为人类寻找到了一条顺应生命的医疗和健康长寿的方法；

2、找到了能维持、支持、激活再生潜能细胞的生命物质；用生命物质代替药物；