HPLC测定复方苦参注射液中苦参碱_槐定碱和氧化苦参碱的含量_田娟
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供试品溶液的制备中曾采用将注射剂直接稀释
表 1 3种成分的加样回收率 (n =6)
样品中含量 加入量 测得量 回收率 平均值 RSD
测定成分
/m g
/m g
/m g
/%
/% /%
苦参碱
槐定碱
氧化苦参碱
0. 395 0. 395 0. 395 0. 395 0. 395 0. 395 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 1. 858 1. 858 1. 858 1. 858 1. 858 1. 858
[ 关键词 ] 高效液相色谱法 ;复方苦参注射液 ;苦参碱 ;槐定碱 ;氧化苦参 碱 [ 中图分类号 ] R 284. 1 [ 文献标 识码 ] A [ 文章编号 ] 1001-5302(2007)03-0222-03
复方苦参注射液是由山西振东金晶制药有限公 司研制生产的纯中药抗癌制剂 , 处方由苦参 、白土苓 组成 , 经过系列精制制成的具有抗癌 、增强免疫 、止 血 、止痛 、抗肿瘤等功效的产品 , 其主要成分为苦参 碱 、槐定碱及氧化苦参碱等生物碱类成分 。 部颁标
准采用酸碱滴定法测定复方苦参注射液中总生物碱 含量[ 1] , 而目前关于苦参及其制剂中生物碱类成分 含量测定仅见 薄层色谱扫描法 [ 2] 、H PLC 测定苦参 碱的报道[ 3, 4] 。 本研究建立了同时测定制剂中 3种 主要生物碱含量的 HPLC 分析方法 , 该法操作简便 、 灵敏度高 、分离度好 , 可用于复方苦参注射液的质量 控制 。 1 仪器和试药
0. 375 0. 375 0. 302 0. 302 0. 480 0. 480 0. 085 0. 085 0. 070 0. 070 0. 110 0. 110 1. 840 1. 840 1. 380 1. 380 2. 320 2. 320
0.763 0.766 0.699 0.695 0.867 0.885 0.172 0.170 0.156 0.155 0.194 0.198 3.708 3.748 3.257 3.206 4.415 4.194
T IAN Juan1, 2, WANG W ei-hao1, GAO Hu i-m in1, W ANG Zhi-m in1 (1. Institute of Chinese Materia Med ica, China Academy of Ch inese M edical S ciences, B eijing 100700, China; 2. College of L ife Science, N orthw est Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, China)
Ch ina Journal o
中药杂志
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o.lLeabharlann Baidu32, Issue 3 Feb ruary, 2007
D eterm ination ofmatrine, sophor id ine and oxymatrine in compound K ushen injection by HPLC
表 2 复方苦参注射液中 3种成分含量 (n =10)
m g mL-1
批号
20040406 20040407 20040409 20040411 20040412 20040413 20041002 20041003 20041001-1 20041001-2
苦参碱
1. 800 2. 347 1. 628 1. 504 1. 658 1. 568 1. 443 1. 354 1. 086 1. 148
槐定碱
0.638 0.589 0.346 0.502 0.527 0.276 0.279 0.331 0.953 0.965
氧化苦参碱
12. 372 11. 051
7. 608 8. 495 9. 289 8. 329 15. 948 13. 553 12. 056 12. 056
进样 , 样品溶液在上述色谱条件下杂质干扰较强 , 3 种生物碱无法得到良好分离 。故采用浓氨水将注射 剂调为碱性 , 使生物碱游离出来后 , 用氯仿少量多次 萃取 , 挥干氯仿 , 无水乙醇稀释进样 , 苦参碱 、槐定碱 和氧化苦参碱均能得到良好分离 。 [参考文献 ]
[ 收稿日期 ] 2005-07-25 [ 通讯作者 ] * 王智 民 , Tel:(010)84014128, E-m ai l:zhmw 123 @ 263. net
222
图 1 对照品和样品 HPLC 图 A. 对照品;B. 样品 ;1. 苦参碱 ;2. 槐定碱 ;3. 氧化苦参碱
2. 4 阴性供试品的考察 取阴性溶液 0.5 mL, 按
的含量 [ J] . 药物分析杂志 , 2000, 20(6):408. [ 4] 曹 红 , 魏 萍. 高效液相色谱法测定磷酸苦 参碱注射液中苦
参碱的含量 [ J] . 解放军药学学报 , 2000, 16(6):325.
2 23
第 32 卷第 3期 2007 年 2月
中 国
田 娟 1, 2 , 王维皓 1 , 高慧敏 1 , 王智民1*
(1. 中国中医科学院 中药研究所 , 北京 100700; 2. 西北农林科技大学 生命学院 , 陕西 杨凌 712100)
[ 摘要 ] 目的 :建立用高效液相色谱法同时测定复方苦参注射液中苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱的 含量。 方法 : A LLT IM A AM INO 色谱柱(4. 6 mm ×250 mm, 5 μm);流动相乙腈 -3%磷酸 溶液-无 水乙醇 (80∶10∶10);流速 1.0 mL m in- 1;检测波长 220 nm;柱温 30 ℃。 结果 :该方 法回收 率苦 参碱为 99.5%(RSD 1.58%), 槐定 碱为 99.2% (RSD 1.44%), 氧化苦参碱为 100. 2%(RSD 1.85%)。 结论 :该方法简便 、快速 、准确 、灵敏度高 , 可用于该品的质量控制 。
[ 1] 中华人 民共和 国卫生 部药品 标准 [ S] . 中药 成方制 剂. 第 14 册, 1995, W S3-B-2752-97.
[ 2] 杨梦玉 , 邬国庆 , 周富 荣. 薄层扫 描法测 定苦参 中苦参 碱的含
量[ J] . 中国中药杂志 , 1999, 24(6):337. [ 3] 马长华 , 曹天海. HPLC 法测定山豆 根中苦参 碱和氧化 苦参碱
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供试品溶液的制备方法制备样品 , 分别精密吸取一 定体积的样品溶液和对照品溶液进样测定 。结果表 明阴性供试品溶液对样品溶液的测定无干扰 。 2. 5 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶 液各 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 μL注入高效液相色谱仪 , 测 定 。以进样量为横坐标 (X ), 峰面积平均积分值为 纵坐标 (Y ), 绘制标准曲线 , 计算回归方程 。 结果表 明苦参碱在 0.050 ～ 0.605 μg线性关系良好 , 回归 方程为 Y =392 424.2X - 968.0(r =0.999 8);槐定 碱在 0.049 ～ 0.590 μg 线性关系良好 , 回归方程为 Y =293 681.1X +404.6(r =0.999 8);氧化苦参碱 在 0.372 ～ 4.464 μg线性关系良好 , 回归方程为 Y = 384 579.5X - 17 318.6(r =0.999 9)。 2. 6 精密度试验 分别精密吸取上述对照品溶液各 5 μL, 连续进样 6次 , 记录各色谱峰的峰面积 , 计算其 相对标准偏差 (RSD)。苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱 峰面积的 RSD分别是 1.91%, 0.92%和 1.86%, 结果 表明 , 仪器精密度良好 。 2. 7 稳定性试验 取同一供试品溶液 , 分别在 0, 1, 2, 4, 8, 16 h进样 , 记录各色谱峰的峰面积 , 测定其 中苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱的含量 , 计算 RSD。 结果分别是 0.84%, 1.36%和 1.76%, 表明低温保 存下的复方苦参注射液稳定性较好 , 常温下 1 d内 也能保持较好的稳定性 。 2. 8 重复性试验 取同一供试品溶液 5份 , 按上述 方法制备样品并进行检测 , 苦参碱 、槐定碱和氧化苦 参碱的质量浓度 分别为 1.580, 0.345, 7.435 m g m L -1 , RSD 分 别为 1.82%, 1.38%和 1.65%, 表明 供试品溶液的制备方法重复性良好 。 2. 9 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品 溶液 6份 , 精密加入适量的苦参碱 、槐定碱和氧化苦 参碱 , 按同样的方法制备供试品溶液 , 测定苦参碱 、 槐定碱和氧化 苦参碱的含量 , 计算回收率 和 RSD, 结果见表 1。 2. 10 样品测定 分别精密吸取对照品溶液 5 μL 与供试品溶液 5 ～ 10 μL, 注入高效液相色谱仪 , 测 定 , 计算样品中苦参碱 、槐定碱和氧 化苦参碱的含 量 , 结果见表 2。 3 讨论
98. 1 99. 51 1. 58 98. 1 100. 6 99. 0 98. 4 102. 1 100. 6 99. 24 1. 44 99. 0 99. 1 97. 8 97. 7 101. 2 100. 5 100. 22 1. 85 102. 7 101. 3 97. 6 98. 5 100. 7
A lltech 426型高效液相泵 , A lltech UV IS 200检 测器 , A llchrom 化 学 工作 站 ;苦 参 碱 (批 号 0805200005)、槐定碱 (批号 0784-9702)及氧化苦参碱对 照品 (批号 0780-200004)购于中国药品生物制品检 定所 , 乙腈 、无水乙醇为色谱纯 , 水为高纯水 , 其余试 剂均为分析纯 ;复方苦参注射液由山西振东金晶制 药 有 限 公 司 提 供 (批 号 20040406, 20040407, 20040409, 20040411, 20040412, 20040413, 20041002, 20041003, 20041001-1, 20041001-2)。
2 方法与结果 2. 1 色谱条件 A lltim a Am ino色谱柱 (4.6 mm × 250 mm , 5 μm );流动相乙 腈 -3%磷酸溶 液 -无水乙 醇 (80∶10∶10);流速 1.0 m L m in- 1 ;检测波长 220 nm ;柱温 30 ℃。 2. 2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷 减压干燥至恒重的苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱对 照品适量 , 加乙腈 -无水乙醇 (80∶20)溶解 , 制成每 1 mL 含苦参碱 0.050 m g, 槐定碱 0.049 m g, 氧化苦参 碱 0.372 m g的混合溶液 , 即得 。 2. 3 供试品溶液的制备 精密量取复方苦参注射 液 0.5 mL, 置分液漏斗中 , 加入浓氨试液约 1 m L, 用 42 m L 氯仿分 3次萃取 (15, 15, 12 m L), 收 集氯仿 液 , 蒸干 , 残渣加无水乙醇适量使溶解 , 并转移至 10 mL 量瓶中 , 加无水乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 用微孔滤 膜 (0.45 μm )滤过 , 取续滤液 , 即得 , 见图 1。
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HPLC 测定复方苦参注射液中苦参碱 、槐定碱 和氧化苦参碱的含量
表 1 3种成分的加样回收率 (n =6)
样品中含量 加入量 测得量 回收率 平均值 RSD
测定成分
/m g
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/%
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苦参碱
槐定碱
氧化苦参碱
0. 395 0. 395 0. 395 0. 395 0. 395 0. 395 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 1. 858 1. 858 1. 858 1. 858 1. 858 1. 858
[ 关键词 ] 高效液相色谱法 ;复方苦参注射液 ;苦参碱 ;槐定碱 ;氧化苦参 碱 [ 中图分类号 ] R 284. 1 [ 文献标 识码 ] A [ 文章编号 ] 1001-5302(2007)03-0222-03
复方苦参注射液是由山西振东金晶制药有限公 司研制生产的纯中药抗癌制剂 , 处方由苦参 、白土苓 组成 , 经过系列精制制成的具有抗癌 、增强免疫 、止 血 、止痛 、抗肿瘤等功效的产品 , 其主要成分为苦参 碱 、槐定碱及氧化苦参碱等生物碱类成分 。 部颁标
准采用酸碱滴定法测定复方苦参注射液中总生物碱 含量[ 1] , 而目前关于苦参及其制剂中生物碱类成分 含量测定仅见 薄层色谱扫描法 [ 2] 、H PLC 测定苦参 碱的报道[ 3, 4] 。 本研究建立了同时测定制剂中 3种 主要生物碱含量的 HPLC 分析方法 , 该法操作简便 、 灵敏度高 、分离度好 , 可用于复方苦参注射液的质量 控制 。 1 仪器和试药
0. 375 0. 375 0. 302 0. 302 0. 480 0. 480 0. 085 0. 085 0. 070 0. 070 0. 110 0. 110 1. 840 1. 840 1. 380 1. 380 2. 320 2. 320
0.763 0.766 0.699 0.695 0.867 0.885 0.172 0.170 0.156 0.155 0.194 0.198 3.708 3.748 3.257 3.206 4.415 4.194
T IAN Juan1, 2, WANG W ei-hao1, GAO Hu i-m in1, W ANG Zhi-m in1 (1. Institute of Chinese Materia Med ica, China Academy of Ch inese M edical S ciences, B eijing 100700, China; 2. College of L ife Science, N orthw est Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, China)
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表 2 复方苦参注射液中 3种成分含量 (n =10)
m g mL-1
批号
20040406 20040407 20040409 20040411 20040412 20040413 20041002 20041003 20041001-1 20041001-2
苦参碱
1. 800 2. 347 1. 628 1. 504 1. 658 1. 568 1. 443 1. 354 1. 086 1. 148
槐定碱
0.638 0.589 0.346 0.502 0.527 0.276 0.279 0.331 0.953 0.965
氧化苦参碱
12. 372 11. 051
7. 608 8. 495 9. 289 8. 329 15. 948 13. 553 12. 056 12. 056
进样 , 样品溶液在上述色谱条件下杂质干扰较强 , 3 种生物碱无法得到良好分离 。故采用浓氨水将注射 剂调为碱性 , 使生物碱游离出来后 , 用氯仿少量多次 萃取 , 挥干氯仿 , 无水乙醇稀释进样 , 苦参碱 、槐定碱 和氧化苦参碱均能得到良好分离 。 [参考文献 ]
[ 收稿日期 ] 2005-07-25 [ 通讯作者 ] * 王智 民 , Tel:(010)84014128, E-m ai l:zhmw 123 @ 263. net
222
图 1 对照品和样品 HPLC 图 A. 对照品;B. 样品 ;1. 苦参碱 ;2. 槐定碱 ;3. 氧化苦参碱
2. 4 阴性供试品的考察 取阴性溶液 0.5 mL, 按
的含量 [ J] . 药物分析杂志 , 2000, 20(6):408. [ 4] 曹 红 , 魏 萍. 高效液相色谱法测定磷酸苦 参碱注射液中苦
参碱的含量 [ J] . 解放军药学学报 , 2000, 16(6):325.
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(1. 中国中医科学院 中药研究所 , 北京 100700; 2. 西北农林科技大学 生命学院 , 陕西 杨凌 712100)
[ 摘要 ] 目的 :建立用高效液相色谱法同时测定复方苦参注射液中苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱的 含量。 方法 : A LLT IM A AM INO 色谱柱(4. 6 mm ×250 mm, 5 μm);流动相乙腈 -3%磷酸 溶液-无 水乙醇 (80∶10∶10);流速 1.0 mL m in- 1;检测波长 220 nm;柱温 30 ℃。 结果 :该方 法回收 率苦 参碱为 99.5%(RSD 1.58%), 槐定 碱为 99.2% (RSD 1.44%), 氧化苦参碱为 100. 2%(RSD 1.85%)。 结论 :该方法简便 、快速 、准确 、灵敏度高 , 可用于该品的质量控制 。
[ 1] 中华人 民共和 国卫生 部药品 标准 [ S] . 中药 成方制 剂. 第 14 册, 1995, W S3-B-2752-97.
[ 2] 杨梦玉 , 邬国庆 , 周富 荣. 薄层扫 描法测 定苦参 中苦参 碱的含
量[ J] . 中国中药杂志 , 1999, 24(6):337. [ 3] 马长华 , 曹天海. HPLC 法测定山豆 根中苦参 碱和氧化 苦参碱
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供试品溶液的制备方法制备样品 , 分别精密吸取一 定体积的样品溶液和对照品溶液进样测定 。结果表 明阴性供试品溶液对样品溶液的测定无干扰 。 2. 5 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶 液各 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 μL注入高效液相色谱仪 , 测 定 。以进样量为横坐标 (X ), 峰面积平均积分值为 纵坐标 (Y ), 绘制标准曲线 , 计算回归方程 。 结果表 明苦参碱在 0.050 ～ 0.605 μg线性关系良好 , 回归 方程为 Y =392 424.2X - 968.0(r =0.999 8);槐定 碱在 0.049 ～ 0.590 μg 线性关系良好 , 回归方程为 Y =293 681.1X +404.6(r =0.999 8);氧化苦参碱 在 0.372 ～ 4.464 μg线性关系良好 , 回归方程为 Y = 384 579.5X - 17 318.6(r =0.999 9)。 2. 6 精密度试验 分别精密吸取上述对照品溶液各 5 μL, 连续进样 6次 , 记录各色谱峰的峰面积 , 计算其 相对标准偏差 (RSD)。苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱 峰面积的 RSD分别是 1.91%, 0.92%和 1.86%, 结果 表明 , 仪器精密度良好 。 2. 7 稳定性试验 取同一供试品溶液 , 分别在 0, 1, 2, 4, 8, 16 h进样 , 记录各色谱峰的峰面积 , 测定其 中苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱的含量 , 计算 RSD。 结果分别是 0.84%, 1.36%和 1.76%, 表明低温保 存下的复方苦参注射液稳定性较好 , 常温下 1 d内 也能保持较好的稳定性 。 2. 8 重复性试验 取同一供试品溶液 5份 , 按上述 方法制备样品并进行检测 , 苦参碱 、槐定碱和氧化苦 参碱的质量浓度 分别为 1.580, 0.345, 7.435 m g m L -1 , RSD 分 别为 1.82%, 1.38%和 1.65%, 表明 供试品溶液的制备方法重复性良好 。 2. 9 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品 溶液 6份 , 精密加入适量的苦参碱 、槐定碱和氧化苦 参碱 , 按同样的方法制备供试品溶液 , 测定苦参碱 、 槐定碱和氧化 苦参碱的含量 , 计算回收率 和 RSD, 结果见表 1。 2. 10 样品测定 分别精密吸取对照品溶液 5 μL 与供试品溶液 5 ～ 10 μL, 注入高效液相色谱仪 , 测 定 , 计算样品中苦参碱 、槐定碱和氧 化苦参碱的含 量 , 结果见表 2。 3 讨论
98. 1 99. 51 1. 58 98. 1 100. 6 99. 0 98. 4 102. 1 100. 6 99. 24 1. 44 99. 0 99. 1 97. 8 97. 7 101. 2 100. 5 100. 22 1. 85 102. 7 101. 3 97. 6 98. 5 100. 7
A lltech 426型高效液相泵 , A lltech UV IS 200检 测器 , A llchrom 化 学 工作 站 ;苦 参 碱 (批 号 0805200005)、槐定碱 (批号 0784-9702)及氧化苦参碱对 照品 (批号 0780-200004)购于中国药品生物制品检 定所 , 乙腈 、无水乙醇为色谱纯 , 水为高纯水 , 其余试 剂均为分析纯 ;复方苦参注射液由山西振东金晶制 药 有 限 公 司 提 供 (批 号 20040406, 20040407, 20040409, 20040411, 20040412, 20040413, 20041002, 20041003, 20041001-1, 20041001-2)。
2 方法与结果 2. 1 色谱条件 A lltim a Am ino色谱柱 (4.6 mm × 250 mm , 5 μm );流动相乙 腈 -3%磷酸溶 液 -无水乙 醇 (80∶10∶10);流速 1.0 m L m in- 1 ;检测波长 220 nm ;柱温 30 ℃。 2. 2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷 减压干燥至恒重的苦参碱 、槐定碱和氧化苦参碱对 照品适量 , 加乙腈 -无水乙醇 (80∶20)溶解 , 制成每 1 mL 含苦参碱 0.050 m g, 槐定碱 0.049 m g, 氧化苦参 碱 0.372 m g的混合溶液 , 即得 。 2. 3 供试品溶液的制备 精密量取复方苦参注射 液 0.5 mL, 置分液漏斗中 , 加入浓氨试液约 1 m L, 用 42 m L 氯仿分 3次萃取 (15, 15, 12 m L), 收 集氯仿 液 , 蒸干 , 残渣加无水乙醇适量使溶解 , 并转移至 10 mL 量瓶中 , 加无水乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 用微孔滤 膜 (0.45 μm )滤过 , 取续滤液 , 即得 , 见图 1。
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HPLC 测定复方苦参注射液中苦参碱 、槐定碱 和氧化苦参碱的含量