如何区分凋亡细胞与坏死细胞

细胞凋亡(Apoptosis) 是生物界广泛存在的一种现象,与其它的生命现象一样具有同等重要

的生理学或病理学意义。尽管其最终结果也是导致细胞死亡,但其诱导因素、发生机制和过程及意义均明显不同于一般的病理性细胞死亡(即细胞坏死性死亡,简称细胞死亡)。

细胞凋亡的形态特征与细胞坏死性死亡的形态特征不同。细胞坏死性死亡是被动的病理性死亡,其形态特征首先是膜通透性增加,细胞外型发生不规则变化,内质网扩张,核染色质不规则移位,进而线粒体及核肿张,溶酶体破坏,细胞膜破裂,胞浆外溢,这种死亡过程常常引起炎症

反应。细胞凋亡则是在某些因素的诱导

下,由细胞内在的有规律的机制引起的 ,是主动的生理性细胞自杀。其特征是细胞首先变圆,随即与邻近细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,线粒体无明显变化 ,核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周边,胞膜内陷将细胞自行分割为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡

小体,后被吞噬细胞或邻周细胞

所识别、吞噬。由于细胞凋亡过程不导致溶酶体破坏及胞膜

破裂,没有细胞内容物外泄,故不

引起炎症反应,在生理条件下,生物体内细胞存活与死亡是由自身发育阶段提供的遗传信

息,

或由邻近细胞和其微环境提供的信号决定的,其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环

境中活性物质、激素等。

这些刺激信号的增加或减少调节着细胞产生和凋亡,维系着机体细胞的有序状态

细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、

生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开

来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面

介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特

征，人

细胞凋亡形态学检测方法。

细胞凋亡(apoptosis)的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般

的形态学特征。

目前对细胞凋亡的认识不断得到深

化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方

法。

光学显微镜观察

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞积缩小.胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞以

分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。

检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片

作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微镜测量工具可作凋亡计

数。

本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困

难，常缺乏较为特

征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法.可用于凋亡现象的初步观察，作为分析

指标之一。

视频时差显微技术（videotime-lapsemicroscopy）

本方法用于细胞培

养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突

起，

持续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可检测培养基中凋亡细胞，

但

不能用于病理组织。

检测方法：收集2x105细胞/ml培养，置于多空培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄

像

装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔30秒作序列摄影，连续24小时。如同时进行荧光染色，可参荧光显微镜下观察和摄

影。

电子显微镜观察

凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固

缩，染色质浓缩成半月板或帽状附于核膜，核的碎裂和

凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依

据。本方

法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂

贵，较难广泛大量开展。由于样品范围局限，在凋亡数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。

检查方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切

片，

醋酸枸橼酸电子重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

一、检测细胞膜成分变化的AnnexinV 联合PI法

磷脂酰丝氨酸外翻分析（ AnnexinV 法）

原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS ）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的

早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探

针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞

以及死细胞区分开来。

方法1悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗

2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光

30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联

合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需

固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA 片段丢失。因此， Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的

检测细胞凋亡的方法。

结果：