时间分辨荧光技术

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所需试剂和仪器
试剂： 1.固定相（96孔板）
2.固相的抗原或抗体（待测物）
3. 标记物：镧系元素离子及其螯合物(铕(Eu)钐(Sm)镝(Dy)、锝(Tb)); 4. 螯合剂、增强液
仪器：时间分辨系统
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TRF分析原理图
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TRFIA反应模式
TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法。 竞争法又有两种： (1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体； (2)固体抗原和游 离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞 争法多用于检测小分子半抗原。 无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子的抗体-抗原免疫复 合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测 物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螫合剂必须一端与镧系稀土离子 结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。 由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产 生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使 镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形 成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应。 此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍。
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时间分辨荧光免疫技术的应用
在药物含量测定中的应用
有研究者建立了环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法，该方法具有灵 敏度高、特异性好、性能稳定的优点，适于高通量筛查。张祯等基于竞 争双标记时间分辨荧光免疫分析技术，建立了一种新的同时测定猪肉组 织中氯霉素和莱克多巴胺的方法。利用两种不同标记的抗体同时检测属 于不同种类的药物残留。
蛋自质定量分析
细胞因子测定方面TRFIA逐渐开始取代RIA、酶联免疫分析(EIA)法。 如测定 CEA 、甲胎蛋白、肿瘤相关抗原等。激素免疫测定 TRFIA 已取代 RIA、EIA等方法，检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的 激素、胰岛素、胃泌素等多方面。
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酶活性的检测
Gabou等用TRFIA技术测量了端粒酶活性。Kavrinen等利用多标记时间 分辨碎灭分析技术实现了对aspase家族多参数活性检测。


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时间分辨荧光免疫技术简介
时间分辨免疫荧光技术的定义
用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、 酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质。 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异 性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定 免疫反应最后产物的荧光强度。 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度， 达到定量分析的目的。
时间分辨荧光技术 （TRFIA）
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主要内容

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时间分辨荧光免疫技术背景

1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理论，1989年该技术
获诺贝尔化学奖提名。
90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高（10-18mol/L)， 操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污 染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景 的分析手段
激发光谱完全分
离
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时间分辨荧光免疫---突出优点

特异性荧光与非特异性荧光分离，发射荧光与激发光分离，零本底、 零背景、高特异性、高灵敏度 荧光性大大提高，稳定的荧光螯合物，线性范围宽 原子标记，标记位点多，可达20个，对标记物结构及活性影响小，无 衰变，受环境影响小。高稳定性，高精确度，试剂有效期长，标准曲 线稳定性好 多标记，同一试剂盒可同时测多个项目，易于自动化 对环境及人体没有任何影响
• 荧光素的Stokes位移为280nm 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm）
4、解离-增强技术 可使其荧光性提高100万倍
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利用镧系元素荧光物
理特性，荧光激发后
在固定时间段检测特 异性荧光而在此时间 之前，非特异性荧光 已完全衰减为0
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巨大Stokes位移
发射光谱与激发 光谱间存在的巨 大Stokes位移。可 以通过干涉滤光 片将发射光谱与
微生物诊断
由于TRFIA灵敏度高，目前TRFIA 已广泛用于各种传染病的诊断及研 究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道 合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。
基因分析
铕标记的链霉亲和素-生物素探针，使核酸杂交整个过程变得快速、简 单。目前，稀土元素标记探针技术已用于检测 HIv 、前列腺特异性抗原 mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA和HLA．27等位基因，获得了满 意的结果。Nurim等使用斓系离子鳌合物标记等位基因特异探针来筛选新 的基因标志。
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加样本
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振荡、洗板
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加入Eu标
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Eu 标 记 物
轻链
螯合剂
Eu
V
重链
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振荡、洗板
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加入解离增强液
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仪器检测
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标记物为稀土金属---镧系元素
铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点： 1、荧光寿命极长 • 镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> • 普通荧光免疫中荧光团：1~100us • 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭 2 、 Stokes 位移大（大约 290nm ）有利于排除非特异荧光的干扰，增强测 量的特异性。 • 铕：激发光340nm、发射光613nm