时间分辨荧光技术原理及应用
时间分辨技术的原理
时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：1、时间分辨原理：用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。
根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。
2、时间分辨原子标记物的特点：●发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性●长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度●半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性原子标记与大分子标记物的对比3、波长分辨：●标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。
●激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。
4、时间分辨：●标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。
●每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值，有利于提高检测的准确性。
时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！RIA（放免）●放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。
●125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。
●由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准曲线无法保存备用。
ELESA（酶免）●灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。
●酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。
与其它技术的相对优势：（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的TRF技术与电化学发光的比较TRF与化学发光的比较时间分辨荧光免疫定量分析简介时间分辨荧光分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
时间分辨荧光光谱中
时间分辨荧光光谱中
时间分辨荧光光谱是一种用于研究物质在光激发后发射出的荧光光谱的技术。
它可以提供关于分子结构、动力学和相互作用的有用信息。
时间分辨荧光光谱通常涉及到以下几个方面：
1. 时间分辨测量原理，时间分辨荧光光谱是通过对样品施加脉冲激发光源，然后测量样品在不同时间点上发射的荧光信号来实现的。
这种方法可以提供有关分子在不同时间尺度上的行为的信息，比如激发态寿命、能级交叉和分子内动力学等。
2. 应用领域，时间分辨荧光光谱在生物化学、材料科学、环境监测等领域有着广泛的应用。
例如，在生物医学领域，可以利用时间分辨荧光光谱研究荧光标记的生物分子在细胞内的动态过程；在材料科学中，可以通过时间分辨荧光光谱来研究半导体材料的光致发光和退火过程。
3. 数据分析，时间分辨荧光光谱产生的数据通常需要经过复杂的数据处理和分析。
这包括对光谱数据进行去噪、拟合和解卷积等处理，以提取出样品的动力学信息。
4. 仪器设备，进行时间分辨荧光光谱实验通常需要高性能的激发光源、光学检测系统和数据采集设备。
常见的实验装置包括飞秒激光器、光电倍增管、光栅和高速数字采集卡等。
总的来说，时间分辨荧光光谱技术在研究分子的动力学过程和相互作用方面具有重要的应用，对于揭示物质的性质和行为具有重要意义。
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
时间分辨荧光技术原理及应用
免疫细胞
免疫器官
按其功能不同分为： 中枢免疫器官：
免疫细胞发生、分化和 成熟的场所。
包括：胸腺和骨髓(人和 哺乳动物)；法式囊(禽类)。
外周免疫器官及组织 ： 1.B细胞成熟的场所； 2.免疫应答的发生部位。 包括：淋巴结 脾脏 粘膜
电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA） 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电 场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
电化学发光免疫测定示意图
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图
钐(Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，锝(Te) 可实现多项目同时检测，
减少操作偶然误差。
原子标记技术
多个标记位点（多达20个）灵敏度更高。 原子标记，对抗体结构影响小，保证检测的高灵敏
性，高精确度。 惰性元素，无衰变保质期1年。 物理发光影响小，受环境影响小，可以多次检测。 解离增强技术可使其荧光性提高100万倍，线性范围
钩状效应在凝集曲线上表现为类似抛物线的形状。
医学免疫学化诊断技术
医学免疫学化诊断技术分为： 同位素放射免疫 非放射免疫分析
吸收光谱法
酶联ELSIA
发射光谱法
酶联化学发光 直接化学发光 电化学发光 荧光偏振 时间分辨
主流化学发光介绍
发光免疫分析：是将发光分析和免疫反应相结合而建立 起来的一种新的检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技 术。
1876年 多种病原菌被发现——疫苗广泛应用
抗原抗体的基本概念
抗原（antigen,Ag)
是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效 应的物质。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨荧光免疫测定原理
时间分辨荧光免疫测定原理时间分辨荧光免疫测定（TRFIA，Time Resolved Fluorescence Immunoassay）是一种非同位素免疫分析技术。
它利用镧系元素（如铕、铽等）标记抗原或抗体，通过测量荧光强度和时间两个参数来检测待测物。
与传统的荧光免疫分析相比，TRFIA具有更高的灵敏度和特异性，能有效排除非特异性荧光的干扰。
TRFIA的分析原理主要包括以下几个方面：1.镧系元素标记：将镧系元素与抗原或抗体结合，形成具有荧光性质的标记物。
镧系元素的荧光具有较长的寿命，且发光强度与抗原或抗体的结合程度密切相关。
2.时间分辨技术：通过时间分辨技术对荧光信号进行测量，即在一定时间内对荧光信号进行积分和分析。
这种技术能够有效地区分特异性荧光信号和背景荧光信号，提高分析灵敏度。
3.信号分辨：通过检测波长和时间两个参数来分辨特异性荧光信号和非特异性荧光信号。
由于生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度会严重下降。
而TRFIA方法通过时间分辨技术使瞬时荧光干扰减到最小化。
4.激发光控制：TRFIA方法在测量时采用延迟测量时间的方法，有效地消除背景荧光的干扰。
同时，解决激发光的杂散光影响也是提高灵敏度的关键。
5.数据分析：通过对测量得到的荧光信号进行数据分析，得到待测物的浓度。
TRFIA方法能够实现对超微量样品的高灵敏度检测，具有很高的分析精度。
总之，时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种基于镧系元素标记、时间分辨技术、信号分辨、激发光控制和数据分析等原理的一种高灵敏度、高特异性的免疫分析方法。
在生物医学、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用前景。
时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)结果
时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)结果时间分辨荧光共振能量转移技术（tr-FRET）是一种通过测量分子间距离变化的荧光共振能量转移技术。
本文将介绍tr-FRET的基本原理、优点、应用和一些相关研究。
基本原理荧光共振能量转移（FRET）是指一种荧光标记分子采用荧光共振原理，通过相互作用，在能量转移过程中从一个荧光分子（供体D）向另一个荧光分子（受体A）传递能量。
能量转移的发生在一定距离（通常小于10nm）内，该距离也被称为FRET距离。
在FRET的过程中，FRET现象被一系列因素所影响，如荧光分子的数量、荧光分子的吸收和辐射频率、荧光分子的寿命和荧光分子的共振距离等。
时间分辨荧光共振能量转移技术是一种用于获取活体分子间的相互作用距离的技术，最早是由Becker and Hickl在1993年开发出来的。
在该技术中，荧光标记分子的差异被利用来测量静态和动态的相互作用。
采用这种技术的主要优点是其高时间分辨率，使得动态分子相互作用的研究成为可能。
优点时间分辨荧光共振能量转移技术具有以下优点：1、高时间分辨率：能够在亚纳秒到微秒的时间尺度上测量分子相互作用。
2、非破坏性：tr-FRET技术不会破坏样本，因此，可以用于在生理条件下收集数据。
3、能够测量交替的能量转移路径：Nanoscale动力学的复杂性往往使得当一个传递能量通道关闭时，决定一个分子体系内分子间距离的其他通道也开始发挥作用。
在这种情况下，tr-FRET技术能够探测多个能量转移路径和物种。
4、操作简单：tr-FRET技术所需要的机器和维护成本低，静态或动态样品都可以使用。
应用时间分辨荧光共振能量转移技术已经被广泛应用于生物和材料科学领域，其应用研究内容包括但不限于以下方面：1、膜蛋白的分子相互作用：时间分辨荧光共振能量转移技术可以测量在生物膜中嵌入的蛋白质分子间的距离和分子相互作用（例如药物与膜受体的相互作用）。
2、蛋白质叠加：时间分辨荧光共振能量转移技术也可以测量蛋白质叠加状态下的分子间距离。
时间分辨荧光分析技术的应用研究
时间分辨荧光分析技术的应用研究时间分辨荧光分析技术是一种基于表面增强荧光技术，结合时间分辨检测和分析的新型荧光分析方法。
其应用涉及化学、生物学、环境监测等多个领域，具有快速、灵敏、高通量等优点。
本文将从时间分辨荧光分析技术的原理和应用角度，探究其在不同领域的应用及前景。
一、技术原理时间分辨荧光分析技术通过对荧光信号的时间分辨和分析，可以得到更全面、准确的研究结果。
其基本原理为：通过引入表面增强荧光剂和金属纳米颗粒等材料，使样品在激发光作用下，发出强烈的荧光信号。
荧光信号在不同的材料表面上，会受到扩散、共振能量转移等影响，产生不同的荧光寿命和谱型。
利用时间分辨荧光分析仪，可以通过研究荧光信号的寿命和谱型，快速有效地分析样品中目标物质的数量、分子结构、反应速率等参数。
二、应用领域2.1 生物学在细胞研究领域，时间分辨荧光分析技术是一种重要的荧光探针和成像工具。
例如，可以通过合成表面增强荧光生物传感器，对等离子体膜上的酶活性、蛋白质结构、细胞内钙离子转运等生物过程进行实时监测和成像。
此外，时间分辨荧光分析技术还可以用于研究荧光标记的生物分子在细胞内部的传递、吸附、反应等过程，为研究基因组学、蛋白质组学等提供了有力的工具。
2.2 化学领域在化学反应动力学研究领域，时间分辨荧光分析技术主要应用于研究化学反应过程中的荧光衰减动力学和反应速率等参数。
例如，利用荧光探针技术，可以对物质分子之间的共振能量转移、酸碱中性化反应、阳离子络合反应等化学反应进行实时监测和定量分析。
此外，时间分辨荧光分析技术还可以用于生化传感器、化学传感器等相关领域的研究。
2.3 环境监测和安全领域在环境监测领域，时间分辨荧光分析技术常用于检测水质中的重金属、污染物等有害成分。
例如，利用荧光标记技术，可以对水中的难降解有机物、重金属等污染物进行定量检测和分析，并快速地监测水质的污染程度。
在安全领域中，时间分辨荧光分析技术还可以用于爆炸物质检测、生化武器检测等方面，具有很强的应用前景。
时间分辨荧光分析法
时间分辨荧光分析法时间分辨荧光分析法是一种基于荧光技术的分析方法，它可以同时以多种波长检测反应材料，并可以指导体内和体外反应过程的动态调控。
它是一种新兴的生物分析技术，在生物化学、生物物理、生物反应、分子细胞学等诸多领域都有重要应用。
时间分辨荧光分析的基本方法是以某种波长的荧光来表征材料的特征参量，以评价它们的动态调控。
这种方法能够识别反应源和动态调控反应结果，从而检测特定材料的存在和变化。
比如，它可以检测细胞表面的特定结构，以及细胞核和质粒中的特定活性，从而可以揭示细胞动态变化的特征和过程。
在时间分辨荧光分析中，研究者可以通过观察荧光信号的变化情况，来判断被观察材料的动态特性。
例如，研究者可以利用这种技术来检测某个物理或化学反应的动态变化，如水合还原反应。
研究者还可以通过时间分辨荧光分析，来检测生物反应的动态变化，如蛋白质的折叠、细胞的凋亡、细胞周期以及信号传导等。
时间分辨荧光分析是一种非常灵活的分析方法，它可用于指导生物反应过程的动态调控和评估反应过程的结果。
对于研究基因调控，蛋白质折叠，细胞凋亡，细胞周期和信号传导等方面的研究，时间分辨荧光分析提供了一种新的手段，可以让研究者更好地理解这些反应过程，从而提高反应的效率。
然而，时间分辨荧光分析的准确性以及它的应用定位也有一定的限制，如果运用不当可能会导致测量结果的偏差。
因此，在使用时间分辨荧光分析技术时，需要按照严格的操作步骤，并进行有效的校正，以保证测量结果的准确性。
总而言之，时间分辨荧光分析法是一种具有重要应用价值的新技术，它可以用于指导某些特定反应的动态调控，并进一步评价各种生物反应的动态变化特征，是一种提高反应效率的有效工具。
不过，在使用时间分辨荧光分析技术时，还需要注意正确的操作步骤和精确的校正，以保证测量结果的准确性。
时间分辨荧光光谱
时间分辨荧光光谱
时间分辨荧光光谱（Time-resolved Fluorescence Spectroscopy，TRFS）是一种利用荧光来获取分子动态信息的
实验技术。
它通过测量荧光发射的光谱来研究物质的动态过程，有助于更好地理解和解释化学反应的机理。
时间分辨荧光光谱与激光技术紧密相关，它使用激光照射被检测物质，由此产生物质的荧光发射，再利用激光瞬时脉冲观察荧光发射的变化，从而获取分子动态信息。
时间分辨荧光光谱具有时间分辨率高、测量数据准确等优点，因此，它已成为研究分子动力学过程的有力工具。
它可以用于研究光致变性，研究分子间相互作用，研究药物分子的药效，评价活性物质的稳定性，以及研究其他物理和化学反应的动力学过程。
此外，时间分辨荧光光谱也可以用于生物医学研究，如研究蛋白质结构变化、研究细胞活性等。
时间分辨荧光光谱是一种灵活性很强的技术，它可以满足多种科学研究需求，是当今研究分子动力学的重要工具。
它的发展对于科学的发展具有重要的意义，也为研究分子动力学提供了新的工具。
时间分辨荧光免疫技术
食品安全检测
兽药残留检测
该技术可用于检测动物性食品中的兽药残留，如抗生素、激素等，保障消费者健 康和食品安全。
非法添加物检测
可用于检测食品中的非法添加物，如瘦肉精、苏丹红等，保障消费者健康和食品 安全。
环境监测
水质监测
时间分辨荧光免疫技术可用于检测水体中的有害物质，如重金属、有机污染物等，为环境保护提供技 术支持。
技术应用领域
临床医学领域
传染病检测
时间分辨荧光免疫技术可用于 检测乙肝、丙肝、艾滋病等传 染病病毒的抗原和抗体，有助
于早期发现和预防传染病。
肿瘤标志物检测
该技术可用于检测肿瘤标志物，如 癌胚抗原、甲胎蛋白等，有助于肿 瘤的早期发现和预后评估。
免疫系统疾病检测
时间分辨荧光免疫技术还可用于检 测自身免疫性疾病、风湿病、红斑 狼疮等免疫系统疾病的相关抗体。
02
在过去的几十年中，TRFIA技术不断取得突破，如采用纳米材料增强荧光信号 、开发多通道TRFIA等方法，使其在灵敏度、特异性、分析速度等方面得到了 显著提升。
03
目前，TRFIA技术已经广泛应用于临床检验、生物分析、环境监测等领域，成 为一种重要的分析工具。未来，随着技术的不断进步和应用领域的拓展， TRFIA技术有望在更多领域发挥重要作用。
总结词
实时、在线、预警。
详细描述
时间分辨荧光免疫技术还可应用于环境污染物监测， 如水体、土壤和空气中的有害物质监测。该技术能够 实时、在线检测环境中的污染物，及时发出预警，为 环境保护和治理提供科学依据。通过该技术的应用， 能够有效地保护环境和人类健康。
THANKS
感谢观看
Hale Waihona Puke 未来发展趋势与前景随着科学技术的不断进步和生物医学领域的需求不断增长，时间分辨荧光免疫技术将继续得到发展和完善。未来 ，该技术将进一步向着高灵敏度、高特异性、高准确性和低成本的方向发展，以适应更多样化的应用场景和更广 泛的临床需求。此外，随着人工智能和大数据等技术的快速发展，时间分辨荧光免疫技术有望与这些技术相结合 ，实现自动化、智能化和远程化的检测和分析，进一步提高检测效率和精度。
时间分辨免疫荧光法
时间分辨免疫荧光法
时间分辨免疫荧光法（Time-resolved Fluorescence Immunoassay，简称TRFIA），是一种利用荧光信号来检测和
定量分析物质浓度的方法。
TRFIA的原理是基于化学发光现象，通过在分析物上标记荧
光分子作为探针，当样品中的分析物与标记的荧光分子结合时，荧光信号会被激发并发出发光。
与传统的荧光免疫分析方法不同的是，TRFIA利用特殊的化学发光体系，使得荧光信号的
发光时间延长，减少背景干扰信号的影响，从而提高了信号的检测灵敏度和准确性。
TRFIA的优点包括高灵敏度、高选择性、较低背景信号和较
大测量范围等。
它通常被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物监测等领域。
常见的应用包括检测肿瘤标志物、药物残留物、免疫球蛋白等。
总结起来，时间分辨免疫荧光法是一种利用荧光信号进行分析和定量测量的方法，其特点是通过延长荧光信号发光时间，提高信号的检测灵敏度和准确性。
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理及应用
自动化程度高
该技术可以实现自动化检测， 提高检测效率，减少人为误 差。
技术挑战
标记物稳定性
荧光标记物的稳定性对检测结果 的准确性影响较大，需要保证标
记物在长时间内保持稳定。
仪器成本
时间分辨荧光免疫分析技术需要使 用特定的荧光检测仪器，仪器成本 较高，限制了该技术的普及应用。
操作复杂度
相对于其他免疫分析技术，时间分 辨荧光免疫分析技术的操作较为复 杂，需要专业人员进行操作和维护。
临床诊断
临床诊断
时间分辨荧光免疫分析技术可用于临床诊断，特别是对肿瘤、传染病、内分泌等疾病进 行检测和诊断。通过检测患者体内的特异性抗体或抗原，实现对疾病的早期发现和准确
诊断。
临床诊断的应用
时间分辨荧光免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等优点，在临床实践 中得到广泛应用。它可用于检测肿瘤标志物、病毒抗体、激素水平等，为医生提供准确
02
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理
荧光物质
荧光物质
荧光物质是时间分辨荧光免疫分析中的关键成分，通常是一些具有较长荧光寿 命的稀土金属离子或螯合物。这些荧光物质在特定波长的光激发下，能够发射 出波长较长、持续时间较长的荧光信号。
荧光物质选择
选择适当的荧光物质是时间分辨荧光免疫分析技术的关键，需要考虑到荧光的 稳定性、特异性、灵敏度以及与抗原或抗体的结合能力等因素。
可靠的诊断依据。
环境监测
环境监测
时间分辨荧光免疫分析技术也可应用于 环境监测，如水质检测、空气质量监测 等。通过标记环境中的有害物质或污染 物，利用荧光信号的发射和检测，实现 对环境质量的实时监控和评估。
VS
环境监测的应用
时间分辨荧光免疫分析技术可用于检测水 中的重金属离子、有毒有机物、细菌和病 毒等，以及空气中的有害气体和颗粒物。 这有助于及时发现环境污染问题，保障公 众健康和生态安全。
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析（time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以镧系元素铕（Eu3+）等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
镧系元素铕（Eu）、钐（Sm）、铽（Tb）和钕（Nd）通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
镧系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出镧系离子，然后与荧光增强液中的β-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强镧系荧光免疫分析（dissociation-enhanced-lanthanidefluoroimmunoassay，DELFIA）。
镧系元素的发光时间延长，如Eu3+和Sm3+的荧光衰变时间分别达到4.3×105ns和4.1×104ns，而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4—10ns，通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，镧系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，stokes位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成（一）Eu3+标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4℃或-20℃保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
（二）固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
时间分辨荧光的基本原理
时间分辨荧光的基本原理
时间分辨荧光是荧光分析技术中一个非常重要的方面。
在传统的荧光分析中，荧光信号一般是由波长小于200nm的红色和蓝色发光分子产生。
这些分子在吸收了光之后，如果遇到合适的激发光源，就会产生一个非常强的发射信号。
这样，一个波长短、强度高、容易检测的红色或蓝色信号就能被检测到，而如果想要获得更多的光谱信息，就需要用波长更长、强度更弱的荧光分子来产生。
但由于大部分荧光分子具有较高的光谱强度和较大的发射截面，传统方法很难分辨它们之间的差别。
随着激光技术和半导体技术在荧光分析中应用得越来越多，人们逐渐发现了利用激光来获得较短波长和较小发射截面而产生的一种新方法——时间分辨荧光。
时间分辨荧光分析主要利用激光脉冲（波长）与荧光分子（离子）之间发生相互作用后产生荧光发射信号这一特性，通过测量该信号与样品发光光强、频率之间的关系来确定样品中存在哪些物质，从而实现对生物样品中物质含量进行分析和定量检测。
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时间分辨免疫荧光法的原理
时间分辨免疫荧光法的原理时间分辨免疫荧光法，这个名字听起来就有点高大上，是吧？其实它就像是科学界的侦探，专门用来抓捕细胞里的小秘密。
想象一下，有一位穿着白大褂的科学家，手里拿着荧光灯，像是在参加一场别开生面的寻宝游戏。
这个方法的核心就是利用荧光染料，给细胞里的某些目标标记上亮闪闪的标签，让它们在显微镜下发光，真的是太酷了！所以，大家可以把它想象成一场神秘的“光影大作战”。
说到原理，时间分辨免疫荧光法的牛逼之处在于，它不仅能让细胞发光，还能“听懂”时间的语言。
好比你在追踪某个明星的行踪，想知道他在什么时候出现在哪个地方。
这个方法就像是给细胞的动态行为打上了时间戳。
每当细胞中的某个成分和荧光标记结合时，它们就会发出光，而这光的强度和时间的长短，可以让科学家们准确地知道这些成分的活动状态。
简单说，就是“我来了，我看到了，我发光了！”这个技术的关键在于，咱们用的荧光染料可不是什么普通的东西。
它们可像小火箭一样，等到特定的时刻才会亮起。
有些染料反应迅速，有些则需要等待，这就让科学家们可以通过观察它们的发光时间，了解细胞的不同反应。
就好比你在吃一碗拉面，面条有的熟得快，有的则慢慢才软，科学家就是在这里当起了“拉面师傅”，认真观察每一根面条的表现。
这技术在研究领域里简直是如虎添翼，无论是基础生物学、癌症研究，还是药物开发，它都能发挥出色的作用。
比如，在癌症研究中，科学家们可以用它来追踪肿瘤细胞的变化，看看它们是如何在时间的流逝中不断变化的。
就像在看一部悬疑剧，剧情总是波澜起伏，没准转眼就有大反转。
这个方法也不是没有挑战。
操作的时候就像做一道精致的菜，调料放多了少了，味道就完全变了。
细胞的环境也要掌控得当，稍微不留神，可能就会影响结果。
要不然就像是你的午餐，微波炉一开，结果变成了大灾难。
科学家们得在实验室里琢磨，这可不是轻松的差事。
说到设备，这玩意儿可是科学界的“高档货”，得配备各种先进的仪器。
你得有荧光显微镜，还要搭配好各种成像系统，保证每一次实验都能万无一失。
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单克隆抗体和多克隆抗体
多克隆抗体：多个抗原决定基——机体—— 多种抗体的混合物 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）： 由一个B细胞克隆产生的、针对某一特定抗 原决定簇的高度特异性抗体
PcAb 低
差
特异性 敏感性
McAb 高
强
单克隆抗体制备
利用抗原抗体特异性的应用
电化学发光
在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，
用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗 体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗 体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微 粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记 抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使 三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与 待测抗原的浓度成正比。
直接化学发光的机理
--- 夹心法
磁微粒
抗体
+
被测抗原
+
带丫啶酯 标记物抗 体
（1） 加入H2O2 （pH<10）
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
冲洗后
酶联化学发光
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免 疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物， 经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光 量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以 浓度。
波长分辨
发射光与激发光波长间巨大 的Stokes位移(波长跃迁)是镧 系元素荧光的重要特征之一； 铕：激发光340nm，发射光 613nm； 荧光素的Stokes位移为280nm， 普通荧光素只有28nm； 狭窄的发射峰，通过波长分 辨，将特异性荧光与非特异 性荧光分辨开来，近“0” 本底的又一保障。
灵敏度高，检测范围广
1.标准曲线近似一条直线，结果更加准确 2.线性范围宽 3.相对误差小CV < 5% 4.试剂批间差最小
时间分辨试剂采用的免疫学方法
双标 UE3 PAPPA Free-hCGβ TSH 17α-OHP
双抗夹心
竞争法
生物素标记的双抗夹心
双抗夹心 双抗夹心 竞争法
免疫学基本原理 时间分辨荧光免疫原理
晁建文 博圣内部培训
免疫学基础
抗体结构和实际应用
时间分辨原理
免疫学的发展
免疫 学是 人类 与传 染病 斗争 的过 程中 发展 起来 的！
现今 1977年
后基因组时代，从功能基因入手， 研究免疫应答与耐受的分子机理， 新型疫苗的设计研制。
分子免疫发展
1957年
原子标记技术
多个标记位点（多达20个）灵敏度更高。 原子标记，对抗体结构影响小，保证检测的高灵敏 性，高精确度。 惰性元素，无衰变保质期1年。 物理发光影响小，受环境影响小，可以多次检测。 解离增强技术可使其荧光性提高100万倍，线性范围 更宽，重复性更好。
时间分辨
极长的荧光衰退时间特征 铕：730000ns，钐：50000ns； 一般荧光物质：10-100ns； 利用镧系元素的荧光特点，通 过检测时间延迟，将特异性荧 光与非特异性荧光分辨开来， 使本底干扰达到近乎于“0 ”； 实验中，每一秒进行1000 次 检测计数，结果重现性强。
免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）
是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。
免疫细胞
免疫器官
按其功能不同分为： 中枢免疫器官： 免疫细胞发生、分化和 成熟的场所。 包括：胸腺和骨髓(人和 哺乳动物)；法式囊(禽类)。
外周免疫器官及组织 ： 1.B细胞成熟的场所； 2.免疫应答的发生部位。 包括：淋巴结 脾脏 粘膜 伴随淋巴组织等。
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图
碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相
载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入
AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。
应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产
物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当 电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出
能量，这一现象称为化学发光。
直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶 酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH 使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发 光。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光 子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲 线上计算出待测抗原的含量。
时间分辨技术
TRF：Time-Resolved fluorometry时间分辨荧光检测 DELFIA: Dissociation-Enhancement Lanthanide Fluorescence Immuno-Assay （解离增强镧系元素荧光免疫检测） 镧系元素共有15 种，常用的有4种: 钐(Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，锝(Te) 可实现多项目同时检测， 减少操作偶然误差。
AFP/Free hCGß 检测原理
uE3检测原理
PAPP-A检测原理
hCGβ检测原理
hTSH检测原理
17-OHP检测原理
TSH试剂盒成分对比
名称 AUTODELFIA （1152人份） DELFIA （960人份）
标准品
质控品 抗-hTSH-铕示踪剂存储液 浓缩洗液 增强液 新生儿hTSH测试缓冲液
免疫球蛋白的功能区
Ig的H链、L链每隔110个氨基酸即由链内二硫键连接形 成一个能行使特定功能的球性单位，称为Ig的结构域或 功能区（domain）。
各功能区的作用
VH和VL:识别和结合 抗原 CH1和CL:同种异型的 遗传标志 CH2:补体C1q结合位 点， IgG可通过胎盘 CH3/CH4:与多种细胞 表面的FcR结合(免疫 调理,I型超敏反应)
1900年
细胞免疫发展
抗原、抗体被发现——免疫化学发展。
1876年
多种病原菌被发现——疫苗广泛应用
抗原抗体的基本概念
抗原（antigen,Ag)
是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效 应的物质。
抗体（antibody,Ab)
是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一 种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗 原特异性地结合，具有免疫功能。
铰链区
位于CH1与CH2 之间，含有丰富的 脯氨酸，因此易伸 展弯曲，而且易被 木瓜蛋白酶、胃蛋 白酶等水解。
J链和分泌片
J链是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆细胞合成， 以二硫键的形式共价结合到Ig的重链上。 分泌片：由黏膜上皮细胞合成和分泌，以非共价形式 结合到二聚体上，保护IgA，使之不受环境中酶的破 坏，并介导IgA的转运
首先是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入 含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即 可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗 涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加 底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
几种常用的方法
双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法 间接法(双抗原夹心法) 捕获法测IgM抗体 应用亲和素和生物素的方法
捕获法测IgM抗体
应用亲和素和生物素的方法
钩状效应（hook effect）
定义：是指抗原过剩致一步法测抗原出现假阴性的现象。
在抗原抗体反应时，抗原抗体须在一定比例范围 内才能出现最大凝集，当标本中待测抗原浓度相当高 时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不 再形成夹心复合物，抗原过量或抗体过量都会导致两 者胶联度降低，从而导致凝集程度与实际浓度不符， 出现结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性 结果。
免疫细胞来源于骨髓
细胞免疫应答的基本过程
免疫应答是十分复杂的过程，此处列出两种基本的免疫应答
抗原抗体反应原理
定义：是指抗原与相应抗体之间发生的特异性结合反应
特异性 比例性 可逆性
抗原抗体反应的三个特点
免疫球蛋白的分子结构
免疫球蛋白的基本结构
四肽链结构 ，链间二硫键连接 两条重链（H）和两条轻链（L） 氨基端和羧基端。
钩状效应在凝集曲线上表现为类似抛物线的形状。
医学免疫学化诊断技术
医学免疫学化诊断技术分为： 同位素放射免疫 非放射免疫分析 吸收光谱法
酶联ELSIA
发射光谱法
酶联化学发光 直接化学发光 电化学发光 荧光偏振 时间分辨
主流化学发光介绍
发光免疫分析：是将发光分析和免疫反应相结合而建立 起来的一种新的检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技 术。 化学发光（chemiluminescence）：是指伴随化学反应过 程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反
根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C） 可变区（V区）： 氨基酸组成、排列顺序变化较大 恒定区（C区）： 氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定
超变区（ HVR）
框架区 轻链： 24-34、50-56、89-97 重链： 31-35、50-65、95-102