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时间分辨荧光免疫层析 技术原理

时间分辨荧光免疫层析 技术原理

时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术(TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,利用
镧系元素标记抗原或抗体,通过时间分辨技术测量荧光。

具体来说,当含有待测抗原(抗体)的样品滴在加样区时,待测样品中的抗原(抗体)与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体(抗原)结合并通过毛细作用向前层析。

当达到检测区后,与检测线上固定的抗体(抗原)结合,形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上,而多余的荧光微
球标记物继续向前层析,与固定在质控线上的二抗结合。

反应结束后,用紫外光源(340nm)对检测区扫描检测,检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm),且衰变时间也较长。

通过
测量延缓时间,待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1-10ns)全部衰变后,再测量稀土元素的特异性荧光,这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。

通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值,即可分析出样品中待测物的浓度。

这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。

以上内容仅供参考,如需更多信息,建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。

[课件]时间分辨荧光技术PPT

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加样本
10
振荡、洗板11加入E Nhomakorabea标12
Eu 标 记 物
轻链 螯合剂
Eu
V
重链
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振荡、洗板
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加入解离增强液
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仪器检测
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标记物为稀土金属---镧系元素
铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点: 1、荧光寿命极长 • 镧系元素螯合物(60~900 us) <铕:714us> • 普通荧光免疫中荧光团:1~100us • 样本中蛋白质荧光:1~10us,易猝灭 2、Stokes位移大(大约290nm)有利于排除非特异荧光的干扰,增强测 量的特异性。 • 铕:激发光340nm、发射光613nm
TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法 。 竞争法又有两种:(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体;(2)固体抗原和游 离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物,竞 争法多用于检测小分子半抗原。 无论何种反应类型,最终都要形成结合有镧系离子的抗体 - 抗原免疫复 合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合,这就需要在标记待测 物质时采用双功能基团结构螯合剂,此螫合剂必须一端与镧系稀土离子 结合,另一端则与抗体上的自由氨基连接,形成免疫复合物。 由于水的淬灭效应,该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产 生的荧光信号相当弱,可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使 镧系元素从免疫复合物中解离,并和增强液中非离子型的表面活性剂形 成大分子微囊,这种微囊可以最大限度地传递能量,阻断水的淬灭效应 。此时,再用紫外光激发就会产生很强的荧光,增强效果可达上百万倍 。
微生物诊断
由于TRFIA灵敏度高,目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研 究,包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道 合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程课件

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程课件

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查(Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法,从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇,以便进而进行诊断,以最大限度地减少异常儿的出生。

血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。

目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征(Down’s Sydrome,DS;又称21三体综合征)和胎儿神经管缺陷(Neural Tube Defects,NTDs),也包括一部分18三体综合征。

产前筛查可以在妊娠早期(7~13周)或中期(14~21周)进行。

目前用于产前筛查的血清学标志物有:甲胎蛋白(AFP)、游离β-)、妊娠相关血浆蛋白(PAPP-A)、绒毛膜促性腺激素(F-β-hCG)、游离雌三醇(uE3抑制素A(inhibin A)等。

产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数(MOM),正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。

产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。

检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物(AFP、F-β-hCG、PAPP-A等)的浓度,将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中,即可得出唐氏综合征(DS)和神经管缺陷(NTD)筛查的结果。

由于目前的技术水平的限制,产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。

假阴性病例因此会误诊,假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。

二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病,发病率约1/800~1/600,男性多于女性。

1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述,因此命名称为Down,s Syndrome,简称DS。

1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体,故又将其命名为21三体综合征。

唐氏综合征的主要临床表现:严重智力低下、愚型面容,约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。

时间分辨免疫荧光技术ppt课件

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根据荧光强度和相对荧光强度比值,判断反应体系中分析物的浓 度,达到定量分析的目的
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什么是时间分辨免疫荧光技术?
例如:
三价稀土离子包括有铕(Eu),钐(Sm),铽 (Tb) ,镝 (Dy)等,它们的荧光 光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长的特点;
在荧光显微镜下,可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复 合物及其存在的部位。
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什么是时间分辨免疫荧光技术?
概念: 时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构
的螯合剂,将镧系元素标记到抗体(或抗原)上,经 免疫反应形成复合物,由于镧系元素能发出荧光,故 分离除去未结合的成分后,利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度,从而推测待测物含量。
钌 无 无 28种临床, 无科研试剂 高
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时间分辨免疫荧光技术优点总结
零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响
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时间分辨免疫荧光技术的应用
甲状腺功能检测
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特点
技术上的先进性
时间、光谱分辨
特异性荧光与非特异 性荧光分离度高
发射荧光与激发荧 光分离度高
零背景、高特异性
解离、增强
荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物
线性范围更宽 重复性更好
标记位点 标记方法
标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小
高稳定性,高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长

时间分辨免疫荧光法

时间分辨免疫荧光法

时间分辨免疫荧光法
时间分辨免疫荧光法(Time-resolved Fluorescence Immunoassay,简称TRFIA),是一种利用荧光信号来检测和
定量分析物质浓度的方法。

TRFIA的原理是基于化学发光现象,通过在分析物上标记荧
光分子作为探针,当样品中的分析物与标记的荧光分子结合时,荧光信号会被激发并发出发光。

与传统的荧光免疫分析方法不同的是,TRFIA利用特殊的化学发光体系,使得荧光信号的
发光时间延长,减少背景干扰信号的影响,从而提高了信号的检测灵敏度和准确性。

TRFIA的优点包括高灵敏度、高选择性、较低背景信号和较
大测量范围等。

它通常被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物监测等领域。

常见的应用包括检测肿瘤标志物、药物残留物、免疫球蛋白等。

总结起来,时间分辨免疫荧光法是一种利用荧光信号进行分析和定量测量的方法,其特点是通过延长荧光信号发光时间,提高信号的检测灵敏度和准确性。

时间分辨荧光免疫技术培训ppt课件

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时间放分射辨免荧疫光分(精析度:10-18mol/L ) 生物芯片 (未知)
时间分辨荧光免疫技术
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25
待测物质浓度与检测手段
10-12
pg/mL
10-9
ng/mL
10-6
μg/mL
临床化学分析
10-3
10-0
mg/mL
g/L
免疫分析
Therapeutic Drugs (药物浓度)
Thyroid Hormone (甲状腺激素)
疾病的发生、发展、疗效、预后是个动态的变化过程, TRFIA定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙肝 的病程、治疗、预后起到动态检测的作用,指导医生治疗。
时间分辨荧光免疫技术
33
33
(1)定量分析HBsAg和HBsAb浓度的变化,可以预
见急性乙肝是否处于恢复期
如HBsAg浓度降低,HBsAb逐渐升高,说明病情正向恢复期发展反 之。反之,HBsAg浓度处于高水平或上升,而HBsAb处于低水平,则容 易发展为慢性乙肝或携带者。

时间分辨荧光法)
时间分辨荧光免疫技术
22
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时间分辨荧光免疫的试剂种类
甲状腺功能检测
▪ TSH,Ultra TSH,T3,T4,FT3,FT4,TBG,TG
性激素类检测
▪ FSH,LH,HCG,ProlactinE2,E3,Testo,Prog,SHBG
肿瘤标记检测
▪ AFP,CEA,PSA,hTG,β-2 Micro,NSE,PAP,PSA(Free/Total), PSA EQM,CA-50,CA-125,CA-199
遗传科检查
▪ 产前筛查:
hAFP/ HCG ,PAPPA

时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。

其主要特点是以镧系元素铕(Eu3+)等标记抗体或抗原为示踪剂,利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰,最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性,还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备,稳定性好,保存期长等诸多优点。

一、基本原理与放免分析相似,总体上分为竞争法和非竞争法两类,前者多用于小分子半抗原,后者用于大分子化合物。

镧系元素铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)和钕(Nd)通过双功能螯合剂,在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。

经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应,测定免疫复合物的荧光强度,就可推算待测物质的浓度。

镧系离子的荧光信号极弱,需要在酸性条件下,解离出镧系离子,然后与荧光增强液中的β-二酮体生成新的螯合物,经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号,其增强效力可达100万倍,故又称解离增强镧系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-lanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)。

镧系元素的发光时间延长,如Eu3+和Sm3+的荧光衰变时间分别达到4.3×105ns和4.1×104ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4—10ns,通过延迟测量时间,使信号不受本底荧光影响。

此外,镧系元素螯合物的激发光波长范围宽,发射光波长范围窄,stokes位移大,有利于排除非特异性散射光的干扰,进一步提高荧光信号的特异性。

二、试剂组成(一)Eu3+标记物:可分为标记抗体、标记抗原,要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。

密封后4℃或-20℃保存,但应避免反复冻融。

若发现蛋白质聚合,非特异性结合升高,则应停止使用。

(二)固相抗体或抗原:固相载体多用聚苯乙烯微孔条,要求透明度高,吸附性能好,材质均匀,孔间差异小,不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异,应引起注意。

均相时间分辨荧光技术 ppt课件

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三、HTRF 技术原理
能量受体:XL665和 第二代受体d2
XL665是一种105 kDa的大型杂六聚体,经过分离后交联,以便在HTRF分析中获得更好的稳定性 并保持其光物理特性。与荧光素不同,它与Eu cryptates完全兼容。它是红移的,其发射更可能远离 可能的中等和复合干扰。
d2 是第二代受体,具有与XL665非常相似的一系列光物理性质,但其特征在于比XL665小100倍
五、HTRF 技术实验方法
HTRF的操作步骤
HTRF操作步骤非常简单,只需要将实验所需试剂 加进去,然后孵育,检测即可。
HTRF实验数据分析
HTRF采用了比值法来处理数据,可以去除溶液通透 率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。
PART 03
应用
HTRF 技术的应用
G蛋白偶联受体研究
受体第二信使检测 受体配体结合
三、HTRF 技术原理
HTRF 技术的能量供体和能量受体
HTRF 的供体是铕穴状化合物( Eu3+ cryptate)(图a) 或Lumi4™铽穴状化合物( Tb2+ cryptate) (图b,未发表结构),后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果,激发效率更高。两者的能量受体 均可为 XL665 和 d2。 XL665 和 d2 激发波长为620nm,发射波长为 665nm,位于红外光区,进一步降 低了生物溶液对实验的影响(生物学成分很少在红外光区有自发荧光)。
胞内信号分子检测
生物标志物检测
基于抗体的夹心法 竞争法检测
01 02
03 04
激酶活性检测
胞外激酶活性检测 胞内激酶活性检测
抗体检测
抗体重链含量测定 抗体轻链含量测定

时间分辨荧光免疫测定

时间分辨荧光免疫测定

时间分辨荧光免疫测定
以常用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分、试管、
仪器组件等的本底荧光干扰,以及激发光源的杂射光的影响,使灵敏
度受到很大限制。

时间分辨荧光免疫测定(timeresolvedfluorescenc eimmunoassay,TR-FIA)是针对这缺点加以改进的一种新型检测技术。

其基本原理是以镧系元素铕(Eu)螯合物作荧光标记物,利用这类荧
光物质有长荧光寿命的特点,延长荧光测量时间,待短寿命的自然本
底荧光完全衰退后再行测定,所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光,从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。

TR-FIA的测定原理见
图17-4。

以双抗体夹心法为例的测定反应程序见图17-5。

其中增强液
的作用是使荧光信号增强。

因为免疫反应完成后,生成的抗原-抗体
-铕标记物复合物在弱碱性溶液中,经激发后所产生的荧光信号甚弱。

在增强液中可至pH2~3,铕离子很容易解离出来,并与增强液中的β-
二酮体生成带有强烈荧光的新的铕螯合物,大大有利于荧光测量。

图17-4 TR-FIA测定原理示意图
图17-5 双抗体夹心法TR-FIA反应程序示意图
所用检测仪器为时间分辨荧光计,与一般的荧光分光光度计不同,采用脉冲光源(每秒闪烁1000次的氙灯),照射样品后即短暂熄灭,
以电子设备控制延缓时间,待非特异本底荧光衰退后,再测定样品发
出的长镧系荧光。

检测灵敏度可达0.2~1ng/ml。

时间分辨荧光免疫技术培训幻灯片PPT

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0.2-300IU/ml 0.2-500ng/ml 5-5000U/L 0.002-75μU/ml
❖ FSH
❖ Prog

❖ Prolactin
0.05-256mU/ml 0.08-120nmol/L 0.04-250ng/ml
0.1-170mU/ml 无 0.5-150ng/ml
ACS-180 1.0-1000IU/ml 0.5-100ng/ml 2-1000U/L 0.03-150μU/ml 0.3-200mU/ml 0.1-40ng/ml 0.3-200ng/ml
❖ 发光过程短,样品不能重复检 测。
❖ 本底较高,易受环境物质干扰。
❖ 仪器故障率较高。
❖ 试剂稳定性较差,需屡次定标。
❖ 检测精度不高,在超微量分析 及早期诊断方面能力缺乏。
❖ 非开放性试剂;试剂价格高。
当免疫反响发生后,根据稀土离子螯合物的荧光光谱 的特点 〔特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命 长〕,用时间分辨荧光分析仪,测定免疫反响最后 产物的荧光强度。
根据荧光强度和相对荧光强度比值,判断反响体系中 分析物的浓度,到达定量分析的目的。
时间分辨荧光免疫原理图
(Time-resolved Fluorescence Immunoassay)
❖ 夹心法、竞争法的标记原理为以后的 检测技术的开展奠定了根底。
❖ 放射性〔125 I〕,对环境的 污染及对身体的危害,该方法 已经为重视环保的国家逐步取 消。〔如整个欧洲仅尚存几个 放免试验室〕
❖ 125 I 的半衰期短而导致其试 剂有效期短。
❖ 标记物125 I 的稳定性差,导 致试剂盒批间、批内的变异较 大;标准曲线有效期短,必须 每次定标,造成浪费。
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• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。11:26:1811:26:1811:2611/11/2020 11:26:18 AM • 11、夫学须志也,才须学也,非学无以广才,非志无以成学。20.11.1111:26:1811:26Nov-2011-Nov-20 • 12、越是无能的人,越喜欢挑剔别人的错儿。11:26:1811:26:1811:26Wednesday, November 11, 2020 • 13、志不立,天下无可成之事。20.11.1120.11.1111:26:1811:26:18November 11, 2020
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+
非特异性荧光背景 人血清白蛋白
人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 稀土螯合物
荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
酶放大免疫分析示意图
双标记测定AFP和β-hCG
β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发,Eu:615 nm, 820 μs;Sm:643 nm, 88 μs
(二)均相免疫分析
• 基于时间分辨荧光共振能量转移 • 无需洗涤、分离、加增强液
• TBP-Eu:Eu3+-二吡啶二胺,最大发射 615nm,供体
(2)增强液
增强原理图
一般增强百万倍
• β-NTA:Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物 • TOPO:荧光增强协同剂 • Triton X-100:表面活性剂,形成胶束 • 醋酸:酸性介质
(3)酶放大
• 酶催化底物,生成的产物与溶液中镧系离 子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复 合物
• ALP
4.激素检测
• 三碘甲状腺原氨酸(T3):竞争法 • 微孔板中加入抗体 • 标准品或样品、铕标记T3 • 加入增强液,测定荧光 • 灵敏度:0.21ng/ml
5.细胞活性检测
T:靶细胞 E:效应细胞
测定细胞活ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原理图
NK细胞活性
• 靶细胞:K562细胞 • 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖,4ºC孵育 • 向靶细胞中加入效应细胞(NK细胞),孵
2. 传染病检测
• 梅毒螺旋体抗体检测:双抗原夹心法
• 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 • 阴性对照、阳性对照和样品加入板上,孵育 • 加入铕标记抗原,孵育 • 加入增强液,检测荧光
• 符合中国药品生物制品鉴定所结果
3.糖尿病检测
• C-肽检测:双抗体夹心法 • 抗体包被微孔板 • 加入标准品或样品 • 加入铕标记抗体 • 增强液,检测荧光 • 灵敏度:0.08ng/ml
• 14、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If I'd gone alone, I couldn't have seen nearly as much, because I wouldn't have known my way about.
5-2 时间分辨荧光免疫分析
郑鹄志 西南大学 化学化工学院
发展历程
• 1979年,可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
• 1983年,建立时间分辨荧光免疫技术,用于测 定HCG和磷酸酯酶A
• “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
育,离心,测上清荧光 • 计算比释放率(%)
实验释放量 − 自然释放量 × 100%
最大释放量 − 自然释放量
• 9、春去春又回,新桃换旧符。在那桃花盛开的地方,在这醉人芬芳的季节,愿你生活像春天一样阳光,心情像桃花一样美丽,日子像桃子一样甜蜜。2 0.11.1120.11.11Wednesday, November 11, 2020
• APC:别藻蓝蛋白,最大发射665nm,受 体
• 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
• 夹心法 • 竞争法 • 间接法 • 捕获法 • 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定HCV抗体
4. 捕获法
捕获法测定抗-CMV IgM
5. 生物素-亲和素法
生物素-亲和素检测PAPP-A
四、应用
• 1. 肿瘤标志物检测 • 2. 传染病检测 • 3. 糖尿病检测 • 4. 激素检测 • 5. 细胞活性检测
1.肿瘤标志物
• AFP测定:双抗体夹心法 • 固相包被抗体 • 加入样品或标准品 • 加入Eu标记抗体 • 加入增强液 • 测定荧光 • 灵敏度:0.17 U/ml
104 -106 ns
2. Stokes位移大
荧光物质 Eu-(β-NTA)3 Sm-(β-NTA)3 Tb-(PTA)3 Dy-(PTA)3
激发波长 340 nm 340 nm 295 nm 295 nm
发射波长 613 nm 600 nm 490/543 nm 573 nm
Stokes位移 273 nm 260 nm
195/248 nm 278 nm
镧系元素发射峰窄
优点
• 灵敏度高(10-18mol/孔) • 原子标记 • 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
• 非均相时间分辨荧光免疫分析 • 均相时间分辨荧光免疫分析
(一)非均相时间分辨荧光免疫分析
• 时间分辨固相免疫分析 • 解离增强荧光免疫分析 • 酶放大免疫分析
1.时间分辨固相免疫分析
灵敏度一般不高
• 实例 • 加拿大Cyber Fluor的FIAgen系统 • Eu3+-BCPDA为标记物
2.解离增强分析
原理示意图
(1)双功能螯合剂
• EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物 • 一端与镧系离子螯合,一端与抗原/抗体连接 • 近中性时,螯合物足够稳定 • 酸性条件下,镧系离子迅速、彻底释放 • Eu-DTTA应用最广泛
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