时间分辨荧光免疫分析.pptx
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• APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受 体
• 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
• 夹心法 • 竞争法 • 间接法 • 捕获法 • 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定HCV抗体
• 14、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If I'd gone alone, I couldn't have seen nearly as much, because I wouldn't have known my way about.
4.激素检测
• 三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法 • 微孔板中加入抗体 • 标准品或样品、铕标记T3 • 加入增强液，测定荧光 • 灵敏度：0.21ng/ml
5.细胞活性检测
T：靶细胞 E：效应细胞
测定细胞活性原理图
NK细胞活性
• 靶细胞：K562细胞 • 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4ºC孵育 • 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵
5-2 时间分辨荧光免疫分析
郑鹄志 西南大学 化学化工学院
发展历程
• 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
• 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测 定HCG和磷酸酯酶A
• “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
195/248 nm 278 nm
镧系元素发射峰窄
优点
• 灵敏度高（10-18mol/孔） • 原子标记 • 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
• 非均相时间分辨荧光免疫分析 • 均相时间分辨荧光免疫分析
（一）非均相时间分辨荧光免疫分析
• 时间分辨固相免疫分析 • 解离增强荧光免疫分析 • 酶放大免疫分析
2. 传染病检测
• 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法
• 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 • 阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育 • 加入铕标记抗原，孵育 • 加入增强液，检测荧光
• 符合中国药品生物制品鉴定所结果
3.糖尿病检测
• C-肽检测：双抗体夹心法 • 抗体包被微孔板 • 加入标准品或样品 • 加入铕标记抗体 • 增强液，检测荧光 • 灵敏度：0.08ng/ml
育，离心，测上清荧光 • 计算比释放率（%）
实验释放量 − 自然释放量 × 100%
最大释放量 − 自然释放量
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。2 0.11.1120.11.11Wednesday, November 11, 2020
酶放大免疫分析示意图
双标记测定AFP和β-hCG
β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 μs；Sm:643 nm, 88 μs
（二）均相免疫分析
• 基于时间分辨荧光共振能量转移 • 无需洗涤、分离、加增强液
• TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射 615nm，供体
104 -106 ns
2. Stokes位移大
荧光物质 Eu-(β-NTA)3 Sm-(β-NTA)3 Tb-(PTA)3 Dy-(PTA)3
激发波长 340 nm 340 nm 295 nm 295 nm
发射波长 613 nm 600 nm 490/543 nm 573 nm
Stokes位移 273 nm 260 nm
• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。11:26:1811:26:1811:2611/11/2020 11:26:18 AM • 11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。20.11.1111:26:1811:26Nov-2011-Nov-20 • 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。11:26:1811:26:1811:26Wednesday, November 11, 2020 • 13、志不立，天下无可成之事。20.11.1120.11.1111:26:1811:26:18November 11, 2020
4. 捕获法
捕获法测定抗-CMV IgM
5. 生物素-亲和素法
生物素-亲和素检测PAPP-A
四、应用
• 1. 肿瘤标志物检测 • 2. 传染病检测 • 3. 糖尿病检测 • 4. 激素检测 • 5. 细胞活性检测
1.肿瘤标志物
• AFP测定：双抗体夹心法 • 固相包被抗体 • 加入样品或标准品 • 加入Eu标记抗体 • 加入增强液 • 测定荧光 • 灵敏度：0.17 U/ml
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+
非特异性荧光背景 人血清白蛋白
人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 稀土螯合物
荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
（2）增强液
增强原理图
一般增强百万倍
Байду номын сангаас
• β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物 • TOPO：荧光增强协同剂 • Triton X-100：表面活性剂，形成胶束 • 醋酸：酸性介质
（3）酶放大
• 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离 子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复 合物
• ALP
1.时间分辨固相免疫分析
灵敏度一般不高
• 实例 • 加拿大Cyber Fluor的FIAgen系统 • Eu3+-BCPDA为标记物
2.解离增强分析
原理示意图
（1）双功能螯合剂
• EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物 • 一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接 • 近中性时，螯合物足够稳定 • 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 • Eu-DTTA应用最广泛
• 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
• 夹心法 • 竞争法 • 间接法 • 捕获法 • 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定HCV抗体
• 14、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If I'd gone alone, I couldn't have seen nearly as much, because I wouldn't have known my way about.
4.激素检测
• 三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法 • 微孔板中加入抗体 • 标准品或样品、铕标记T3 • 加入增强液，测定荧光 • 灵敏度：0.21ng/ml
5.细胞活性检测
T：靶细胞 E：效应细胞
测定细胞活性原理图
NK细胞活性
• 靶细胞：K562细胞 • 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4ºC孵育 • 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵
5-2 时间分辨荧光免疫分析
郑鹄志 西南大学 化学化工学院
发展历程
• 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
• 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测 定HCG和磷酸酯酶A
• “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
195/248 nm 278 nm
镧系元素发射峰窄
优点
• 灵敏度高（10-18mol/孔） • 原子标记 • 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
• 非均相时间分辨荧光免疫分析 • 均相时间分辨荧光免疫分析
（一）非均相时间分辨荧光免疫分析
• 时间分辨固相免疫分析 • 解离增强荧光免疫分析 • 酶放大免疫分析
2. 传染病检测
• 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法
• 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 • 阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育 • 加入铕标记抗原，孵育 • 加入增强液，检测荧光
• 符合中国药品生物制品鉴定所结果
3.糖尿病检测
• C-肽检测：双抗体夹心法 • 抗体包被微孔板 • 加入标准品或样品 • 加入铕标记抗体 • 增强液，检测荧光 • 灵敏度：0.08ng/ml
育，离心，测上清荧光 • 计算比释放率（%）
实验释放量 − 自然释放量 × 100%
最大释放量 − 自然释放量
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。2 0.11.1120.11.11Wednesday, November 11, 2020
酶放大免疫分析示意图
双标记测定AFP和β-hCG
β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 μs；Sm:643 nm, 88 μs
（二）均相免疫分析
• 基于时间分辨荧光共振能量转移 • 无需洗涤、分离、加增强液
• TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射 615nm，供体
104 -106 ns
2. Stokes位移大
荧光物质 Eu-(β-NTA)3 Sm-(β-NTA)3 Tb-(PTA)3 Dy-(PTA)3
激发波长 340 nm 340 nm 295 nm 295 nm
发射波长 613 nm 600 nm 490/543 nm 573 nm
Stokes位移 273 nm 260 nm
• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。11:26:1811:26:1811:2611/11/2020 11:26:18 AM • 11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。20.11.1111:26:1811:26Nov-2011-Nov-20 • 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。11:26:1811:26:1811:26Wednesday, November 11, 2020 • 13、志不立，天下无可成之事。20.11.1120.11.1111:26:1811:26:18November 11, 2020
4. 捕获法
捕获法测定抗-CMV IgM
5. 生物素-亲和素法
生物素-亲和素检测PAPP-A
四、应用
• 1. 肿瘤标志物检测 • 2. 传染病检测 • 3. 糖尿病检测 • 4. 激素检测 • 5. 细胞活性检测
1.肿瘤标志物
• AFP测定：双抗体夹心法 • 固相包被抗体 • 加入样品或标准品 • 加入Eu标记抗体 • 加入增强液 • 测定荧光 • 灵敏度：0.17 U/ml
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+
非特异性荧光背景 人血清白蛋白
人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 稀土螯合物
荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
（2）增强液
增强原理图
一般增强百万倍
Байду номын сангаас
• β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物 • TOPO：荧光增强协同剂 • Triton X-100：表面活性剂，形成胶束 • 醋酸：酸性介质
（3）酶放大
• 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离 子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复 合物
• ALP
1.时间分辨固相免疫分析
灵敏度一般不高
• 实例 • 加拿大Cyber Fluor的FIAgen系统 • Eu3+-BCPDA为标记物
2.解离增强分析
原理示意图
（1）双功能螯合剂
• EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物 • 一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接 • 近中性时，螯合物足够稳定 • 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 • Eu-DTTA应用最广泛