时间分辨荧光免疫分析技术

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一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA） （Time-resolved fluorescence immunoassay）
背景介绍 基本原理 技术特点 反应模式
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背景介绍
1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini 和 Hemmila首次提出了建立 稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论
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半自动 ANYTEST2000
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DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪
【粤食药管械（准）字2005第2400226】
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达瑞公司开发的系列TRF试剂
内分泌科检查 肿瘤科检查
甲状腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、 TBG、TG、TGAb、TPoAb
糖尿病系列：insulin、C-Peptide 生长激素：hGH 其他：Cortisol AFP、CEA、tPSA 、β2-MG 、hTG、 CA-242、CA-724 、 CA-50 、 fPSA 、 NSE 、 cyfra 211 、 CA-199、CA-125、CA153
传染病检查
妇产科检查
血液科检查 遗传科检查 2020/12/19
时间分辨荧光免疫分析技术
达瑞抗体
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标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997)
600 发射光波长(nm)
0 200 400
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TRFIA技术特点
极长的荧光衰退时间 铕：730000ns
Stokes位移大 铕：激发光340nm，发射光613nm
狭窄的发射峰
解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
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双抗体夹心法示意图
固相包被抗体
Eu
+
+
待测抗原
铕标记抗体
FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物， 通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足
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碱性
DELFIA标记技术
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通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使理论本底达到0
1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen
2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖
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基本原理
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy) 等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长 的特点
1983年，Soini 和 Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨 荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年， Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素 (hCG)进行了时间 分辨荧光免疫分析
1984年， Hemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成 为Wallac的专利技术
乙肝系列： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb
国外仪器（Wallac公司<PerkinElmer>） 国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等) 达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）
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Wallac AutoDELFIA 1235
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半自动 VICTOR2 1420
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DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu) 为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具 有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTAEu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地 放大
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⑥电化学发光 ⑤时间分辨荧光 ④化学发光 ③酶联免疫 ②放射免疫 ①免疫荧光
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标记免疫技术的理论检测灵敏度
放射免疫 酶联免疫 化学发光 时间分辨荧光 电化学发光
10-10-10-12 mol 10-9-10-10 mol 10-15 mol 10-18 mol 10-18 mol
孵育
Eu + 增强液
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Eu
+ Eu 13
双抗原夹心法示意图
固相包被抗原 +
孵育
待测抗体
Eu +
增强液
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Eu
孵育
+
铕标记抗原
+
Eu
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中和法示意图(回滴定法)
+
+
中和抗原 待测抗体
孵育
+ Eu
铕标记抗体
孵育
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+ 增强液 Eu
Eu + Eu 15
340nm激发光
第二个循环
荧 光
613nm长寿命荧光 短 寿 命 荧 光
0
400
800
2020/12/19 延迟时间
测值时间
1000
时间:(µs） 9
激发光 荧 光 强 度
发射光
300
400
500
600
波长(nm)
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10
500 2020/12/19
Tb
Dy
Eu
Sm
发 射 光 强 度
小分子抗原竞争抑制示意图
固相包被二抗 + 一抗
孵育
+
+
孵育 Eu
待测抗原
铕标抗原
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+ 增强液 Eu
Eu
+ Eu 16
时间分辨技术重点和难点
固定相（96孔板） 标准品 铕标记物
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二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA） 测试仪
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目前的TRFIA测试仪：