时间分辨免疫荧光技术ppt课件
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免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
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2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
时间分辨荧光技术TRFIA技术培训资料-PPT课件
应 用
• 单个样本检测速度快，适合做 急诊 • 灵敏度较高 • 自动化程度高 • 分类： – 以丫啶酯直接标记 – 以HRP标记，鲁米诺为发 光底物—Amerlite系统 – 以AP(碱性磷酸酶 )为标记 物，AMPPD为发光底物
化学发光免疫分析法
问 题 • • • • • 样品不能重复检测 本底较高 仪器故障率较高 试剂稳定性较差 检测精度不高，在超微 量分析及早期诊断方面 能力不足 • 非开放性试剂；试剂价 格高
TRF分析原理图（2）
利用镧系元素荧光物 理特性，荧光激发后 在固定时间段检测特 异性荧光而在此时间
之前，非特异性荧光
已完全衰减为0
标记物为稀土金属---镧系元素
2、Stokes位移大（大约290nm）
• 铕：激发光340nm、发射光613nm • 荧光素的Stokes位移为280nm 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm）
时间分辨免疫荧光技术的定义
• 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标 记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质 • 当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、 核酸探针杂交等反应，经解离—增强作用， 用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强 度 • 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反 应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目 的
二、时间分辨荧光技术
（Time-Resolved Fluorescence）
时间分辨荧光发展史
1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理 论，1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵 敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样 品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方 法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研 究中最有发展前景的分析手段
• 单个样本检测速度快，适合做 急诊 • 灵敏度较高 • 自动化程度高 • 分类： – 以丫啶酯直接标记 – 以HRP标记，鲁米诺为发 光底物—Amerlite系统 – 以AP(碱性磷酸酶 )为标记 物，AMPPD为发光底物
化学发光免疫分析法
问 题 • • • • • 样品不能重复检测 本底较高 仪器故障率较高 试剂稳定性较差 检测精度不高，在超微 量分析及早期诊断方面 能力不足 • 非开放性试剂；试剂价 格高
TRF分析原理图（2）
利用镧系元素荧光物 理特性，荧光激发后 在固定时间段检测特 异性荧光而在此时间
之前，非特异性荧光
已完全衰减为0
标记物为稀土金属---镧系元素
2、Stokes位移大（大约290nm）
• 铕：激发光340nm、发射光613nm • 荧光素的Stokes位移为280nm 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm）
时间分辨免疫荧光技术的定义
• 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标 记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质 • 当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、 核酸探针杂交等反应，经解离—增强作用， 用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强 度 • 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反 应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目 的
二、时间分辨荧光技术
（Time-Resolved Fluorescence）
时间分辨荧光发展史
1979年，提出“时间分辨荧光免疫分析”理 论，1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵 敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样 品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方 法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研 究中最有发展前景的分析手段
[课件]时间分辨荧光技术PPT
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9
加样本
10
振荡、洗板11加入E Nhomakorabea标12
Eu 标 记 物
轻链 螯合剂
Eu
V
重链
13
振荡、洗板
14
加入解离增强液
15
16
仪器检测
17
标记物为稀土金属---镧系元素
铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点： 1、荧光寿命极长 • 镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> • 普通荧光免疫中荧光团：1~100us • 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭 2、Stokes位移大（大约290nm）有利于排除非特异荧光的干扰，增强测 量的特异性。 • 铕：激发光340nm、发射光613nm
TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法 。 竞争法又有两种：(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体；(2)固体抗原和游 离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞 争法多用于检测小分子半抗原。 无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子的抗体 - 抗原免疫复 合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测 物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螫合剂必须一端与镧系稀土离子 结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。 由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产 生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使 镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形 成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应 。此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍 。
微生物诊断
由于TRFIA灵敏度高，目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研 究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道 合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。
加样本
10
振荡、洗板11加入E Nhomakorabea标12
Eu 标 记 物
轻链 螯合剂
Eu
V
重链
13
振荡、洗板
14
加入解离增强液
15
16
仪器检测
17
标记物为稀土金属---镧系元素
铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点： 1、荧光寿命极长 • 镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> • 普通荧光免疫中荧光团：1~100us • 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭 2、Stokes位移大（大约290nm）有利于排除非特异荧光的干扰，增强测 量的特异性。 • 铕：激发光340nm、发射光613nm
TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法 。 竞争法又有两种：(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体；(2)固体抗原和游 离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞 争法多用于检测小分子半抗原。 无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子的抗体 - 抗原免疫复 合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测 物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螫合剂必须一端与镧系稀土离子 结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。 由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产 生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使 镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形 成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应 。此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍 。
微生物诊断
由于TRFIA灵敏度高，目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研 究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道 合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。
均相时间分辨荧光技术 ppt课件
三、HTRF 技术原理
能量受体：XL665和 第二代受体d2
XL665是一种105 kDa的大型杂六聚体，经过分离后交联，以便在HTRF分析中获得更好的稳定性 并保持其光物理特性。与荧光素不同，它与Eu cryptates完全兼容。它是红移的，其发射更可能远离 可能的中等和复合干扰。
d2 是第二代受体，具有与XL665非常相似的一系列光物理性质，但其特征在于比XL665小100倍
五、HTRF 技术实验方法
HTRF的操作步骤
HTRF操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂 加进去，然后孵育，检测即可。
HTRF实验数据分析
HTRF采用了比值法来处理数据，可以去除溶液通透 率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。
PART 03
应用
HTRF 技术的应用
G蛋白偶联受体研究
受体第二信使检测 受体配体结合
三、HTRF 技术原理
HTRF 技术的能量供体和能量受体
HTRF 的供体是铕穴状化合物（ Eu3+ cryptate）（图a） 或Lumi4™铽穴状化合物（ Tb2+ cryptate） （图b，未发表结构），后者是近年与Lumiphore 公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受体 均可为 XL665 和 d2。 XL665 和 d2 激发波长为620nm，发射波长为 665nm，位于红外光区，进一步降 低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。
胞内信号分子检测
生物标志物检测
基于抗体的夹心法 竞争法检测
01 02
03 04
激酶活性检测
胞外激酶活性检测 胞内激酶活性检测
抗体检测
抗体重链含量测定 抗体轻链含量测定
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
时间分辨荧光免疫技术培训幻灯片PPT
0.2-300IU/ml 0.2-500ng/ml 5-5000U/L 0.002-75μU/ml
❖ FSH
❖ Prog
❖
❖ Prolactin
0.05-256mU/ml 0.08-120nmol/L 0.04-250ng/ml
0.1-170mU/ml 无 0.5-150ng/ml
ACS-180 1.0-1000IU/ml 0.5-100ng/ml 2-1000U/L 0.03-150μU/ml 0.3-200mU/ml 0.1-40ng/ml 0.3-200ng/ml
❖ 发光过程短，样品不能重复检 测。
❖ 本底较高，易受环境物质干扰。
❖ 仪器故障率较高。
❖ 试剂稳定性较差，需屡次定标。
❖ 检测精度不高，在超微量分析 及早期诊断方面能力缺乏。
❖ 非开放性试剂；试剂价格高。
当免疫反响发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱 的特点 〔特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命 长〕，用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反响最后 产物的荧光强度。
根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反响体系中 分析物的浓度，到达定量分析的目的。
时间分辨荧光免疫原理图
（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）
❖ 夹心法、竞争法的标记原理为以后的 检测技术的开展奠定了根底。
❖ 放射性〔125 I〕，对环境的 污染及对身体的危害，该方法 已经为重视环保的国家逐步取 消。〔如整个欧洲仅尚存几个 放免试验室〕
❖ 125 I 的半衰期短而导致其试 剂有效期短。
❖ 标记物125 I 的稳定性差，导 致试剂盒批间、批内的变异较 大；标准曲线有效期短，必须 每次定标，造成浪费。
(10检本)第七章-荧光免疫技术PPT课件
• 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经 标本反射进入物镜。
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
-
31
第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
-
• (E)
-
49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
-
50
7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
-
20
标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
-
21
二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
-
22
试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
-
23
返回
-
24
-
25
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
-
31
第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
-
• (E)
-
49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
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50
7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
-
20
标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
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21
二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
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22
试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
-
23
返回
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24
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25
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)
均相时间分辨荧光技术 ppt课件
让-马里·莱恩（Jean-Marie Lehn，1939年9月30日出生）是法 国化学家。他于1987年与Donald Cram和Charles Pedersen因为他的 穴状配合物的合成，一起获得了诺贝尔化学奖
让-马里·莱恩 （Jean-Marie Lehn）
背景简介——穴状配合物
穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼 能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于 跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合 体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子 （ Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（ EDTA）、溶剂或者温度。
从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血 清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗 干扰性，对实验没有干扰而给实验提供了很大的灵活性。
穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需 要的次数去读，这就给许多动力学检测提供了可能。
专利号： US Patent US 5,527,684 由于在该结构上的贡献，让-马 里·莱恩在 1987 年获得了诺贝尔 奖。
时间分辨荧光（ TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特 性质。在 TRF 中常用的镧系元素是钐（ Sm）、铕（ Eu）、 铽（ Tb）和镝（ Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大 的Stoke's shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒）， 这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。
一、时间分辨荧光
镧系元素是57～71的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们都是稀 土元素的成员。
背景简介——穴状配合物
Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免 疫化验的经验，通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面 研究合作，造就了如今的HTRF技术。如今，全球各大制药企业、药 物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行 药物研发。
让-马里·莱恩 （Jean-Marie Lehn）
背景简介——穴状配合物
穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼 能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于 跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合 体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子 （ Mg2+和 Mn2+等）、螯合物（ EDTA）、溶剂或者温度。
从 HTRF 能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血 清在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗 干扰性，对实验没有干扰而给实验提供了很大的灵活性。
穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需 要的次数去读，这就给许多动力学检测提供了可能。
专利号： US Patent US 5,527,684 由于在该结构上的贡献，让-马 里·莱恩在 1987 年获得了诺贝尔 奖。
时间分辨荧光（ TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特 性质。在 TRF 中常用的镧系元素是钐（ Sm）、铕（ Eu）、 铽（ Tb）和镝（ Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大 的Stoke's shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒）， 这使它们在生物学荧光应用领域中日益重要。
一、时间分辨荧光
镧系元素是57～71的15种化学元素的统称。包括镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥，它们都是稀 土元素的成员。
背景简介——穴状配合物
Cisbio Bioassays最初在体外诊断方面的成就提供了丰富的免 疫化验的经验，通过与Jean-Marie Lehn 教授在稀土荧光特性方面 研究合作，造就了如今的HTRF技术。如今，全球各大制药企业、药 物研究所和新药筛选中心都将HTRF作为重要的化合物筛选方法进行 药物研发。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
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根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓 度，达到定量分析的目的
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
例如：
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，它们的荧光 光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长的特点；
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复 合物及其存在的部位。
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
概念： 时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构
的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经 免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故 分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。
钌 无 无 28种临床, 无科研试剂 高
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时间分辨免疫荧光技术优点总结
零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响
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时间分辨免疫荧光技术的应用
甲状腺功能检测
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特点
技术上的先进性
时间、光谱分辨
特异性荧光与非特异 性荧光分离度高
发射荧光与激发荧 光分离度高
零背景、高特异性
解离、增强
荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物
线性范围更宽 重复性更好
标记位点 标记方法
标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小
高稳定性，高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长
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什么是免疫荧光技术？
基本原理：
免疫荧光技术是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记 技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其 免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检 测和鉴定未知的抗原。
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
基本原理：
用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、 酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；
当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特 异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分 析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度；
单、双标记 同一试剂盒可同时测多个项目
多标记
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时间分辨免疫荧光分析相较于化学发光的优势
• 发光效率 • 重复检测 • 本底噪声 • 灵敏级数 • 标记物 • 标记位点 • 标准曲线 • 多标记 • 科研开发
时间分辨荧光
95% 可无数次 零本底 10-18 原子 可达20个/抗体 稳定达一年以上 最多可达四标记 有
化学发光
1% 不可重复 干扰大 10-15 大分子化合物 1个/抗体 稳定 2 到 4周 无 无
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时间分辨荧光和电化学发光比较的优势
• 标记物 • 多标记技术 • 做科研 • 试剂种类 • 试剂价格
时间分辨荧光
电化学发光
Eu, Sm, Te, Dy 有 能 58种临床,24种科研 低
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通过时间延迟，将特异性荧光 与非特异性荧光分辨开来
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时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？
精确度上的优势:
放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L） 胶体金标记 （精度：10-15mol/L） 化学发光 （精度：10-15mol/L） 电化学发光 （精度：10-17mol/L） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）
采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其 一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2 连接；
在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在 增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放 出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千 万倍地放大。
时间分辨免疫荧光技术
1
主要内容
目前有哪些标记免疫学分析方法？ 什么是免疫荧光技术？ 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？ 时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？
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目前有哪些标记免疫学分析方法？
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶联免疫分析 (Engvall, 1971) 胶体金标记免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 生物芯片(美国Luminex公司, 1997)
胰岛素瘤的诊断
对诊断肢端肥大症是一项特异的方法
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时间分辨免疫荧光技术的应用
妇产科检查：
hCG
绒毛膜促性腺激素
LH-Spec 黄体生成素(特异性)
FSH
Hale Waihona Puke 促卵泡激素PRL催乳素
E2
雌二醇
Testo 睾酮
Prog
孕酮
SHBG 性激素结合球蛋白
意义：
检测这些激素的含量对于生殖生 理的研究、疾病的诊断、治疗、随 访及计划生育工作的开展具有重要 的意义。
T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、 Ab 、TPO Ab
内分泌检测 糖尿病指标检测
胰岛素、C－肽
意义：
生长激素检测
hGH（生长激素）
甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，以上各项目的联合检测，
为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据
用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和用于
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
例如：
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，它们的荧光 光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长的特点；
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复 合物及其存在的部位。
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
概念： 时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构
的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经 免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故 分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。
钌 无 无 28种临床, 无科研试剂 高
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时间分辨免疫荧光技术优点总结
零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响
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时间分辨免疫荧光技术的应用
甲状腺功能检测
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特点
技术上的先进性
时间、光谱分辨
特异性荧光与非特异 性荧光分离度高
发射荧光与激发荧 光分离度高
零背景、高特异性
解离、增强
荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物
线性范围更宽 重复性更好
标记位点 标记方法
标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小
高稳定性，高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长
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什么是免疫荧光技术？
基本原理：
免疫荧光技术是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记 技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其 免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检 测和鉴定未知的抗原。
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什么是时间分辨免疫荧光技术？
基本原理：
用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、 酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；
当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特 异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分 析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度；
单、双标记 同一试剂盒可同时测多个项目
多标记
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时间分辨免疫荧光分析相较于化学发光的优势
• 发光效率 • 重复检测 • 本底噪声 • 灵敏级数 • 标记物 • 标记位点 • 标准曲线 • 多标记 • 科研开发
时间分辨荧光
95% 可无数次 零本底 10-18 原子 可达20个/抗体 稳定达一年以上 最多可达四标记 有
化学发光
1% 不可重复 干扰大 10-15 大分子化合物 1个/抗体 稳定 2 到 4周 无 无
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时间分辨荧光和电化学发光比较的优势
• 标记物 • 多标记技术 • 做科研 • 试剂种类 • 试剂价格
时间分辨荧光
电化学发光
Eu, Sm, Te, Dy 有 能 58种临床,24种科研 低
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通过时间延迟，将特异性荧光 与非特异性荧光分辨开来
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时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？
精确度上的优势:
放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L） 胶体金标记 （精度：10-15mol/L） 化学发光 （精度：10-15mol/L） 电化学发光 （精度：10-17mol/L） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）
采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其 一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2 连接；
在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在 增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放 出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千 万倍地放大。
时间分辨免疫荧光技术
1
主要内容
目前有哪些标记免疫学分析方法？ 什么是免疫荧光技术？ 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？ 时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？
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目前有哪些标记免疫学分析方法？
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶联免疫分析 (Engvall, 1971) 胶体金标记免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 生物芯片(美国Luminex公司, 1997)
胰岛素瘤的诊断
对诊断肢端肥大症是一项特异的方法
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妇产科检查：
hCG
绒毛膜促性腺激素
LH-Spec 黄体生成素(特异性)
FSH
Hale Waihona Puke 促卵泡激素PRL催乳素
E2
雌二醇
Testo 睾酮
Prog
孕酮
SHBG 性激素结合球蛋白
意义：
检测这些激素的含量对于生殖生 理的研究、疾病的诊断、治疗、随 访及计划生育工作的开展具有重要 的意义。
T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、 Ab 、TPO Ab
内分泌检测 糖尿病指标检测
胰岛素、C－肽
意义：
生长激素检测
hGH（生长激素）
甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，以上各项目的联合检测，
为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据
用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和用于