免疫荧光技术课件

多甲藻叶绿素蛋白 （PerCP） PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约 为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后， 发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 碘化丙啶（ propidium iodide，PI）
免疫荧光技术
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技术原理
实验流程
注意事项
常见问题
免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在 细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激 发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或 组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。
酶作用后产生荧光的物质 某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为 360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧 化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 镧系 镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激 发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发 射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间
活细胞动态观察。
荧光显微镜的不足之处：
1、无法实现对荧光、透射光的同时采集，无法实现多重荧光的同时采集和共定位。 2、荧光的散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3、荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4、无法对样品进行断层扫描，完成3D的工作。 5、滤镜对荧光信号衰减大，灵敏度和荧光强度不够。 6、可以观察活细胞和组织，但是细胞或组织内机构高度重叠。 7、只能在二维坏境下观察。 8、样品不能太厚。
目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：
异硫氰酸荧光 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精 溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。 FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm， 呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其 主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
一般常用DAPI复染。
7、封片： 为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液； 避免产生气泡。
5、二抗孵育条件：
二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索；
而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度； 切记要避光反应；
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和 孵育时间；
合物（荧光抗体）。 自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。 漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。
多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用
多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，
氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
6. 二抗孵育（二抗种属，湿盒，室温1h，避光，PBS漂洗）；
7. 复染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）； 8. 封片（荧光淬灭剂的封片液）；
9. 荧光显微镜下观察采集图像。
免疫荧光实验流程中一些注意事项
1. 细胞的固定
【固定的定义】
将新鲜的活体组织或细胞，立即加入固定液中，以此使细胞保持原有形态、结构的一种方法。
最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留， 需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
8、切片清洗：
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间
和增多次数）尤为重要，一般在一抗的清洗是5min*3次； 注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
2、一抗的选择要点和技巧是什么？ （1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆 抗 体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面， 即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗 体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对 小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高， 但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
一平面的偏振荧光(525nm)。
偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的 速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素 的测定。
激光共聚焦扫描显微镜 （Confocal laser scanning microscope，CLSM）
用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集 共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经 一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品 不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟， 就能显示细胞样品的立体结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的
可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需 用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm 波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 FL2探测器检测PI。
细胞爬片免疫荧光实验流程
1. 细胞爬片的制作； 2. 固定（4%的多聚甲醛）； 3. 细胞膜通透（0.5%Triton X-100，20min）； 4. 封闭（6%山羊血清，30min）； 5. 一抗孵育（一抗浓度，湿盒，4℃过夜，PBS漂洗）；
藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE） PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最 大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激 光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐 使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。
用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号
分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
荧光偏振免疫分析技术
荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)
是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振 光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单
四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定， 可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色 荧光。 四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉 末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光， 与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可 用于单独标记染色。
免疫荧光技术常见问题
1、石蜡切片和冰冻切片的比较？ （1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会 破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切 片的，可作冰冻切片。 （2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫荧光时不需抗原 修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚 度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切 片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 （3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片 比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中。由于石蜡切片可以切到4微米左右，抗体 容易渗透到组织中去，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
【固定的意义】
1、组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，原位保存抗原，避免抗原失活 或弥散。 2、停止细胞中的生化反应，固定其中的各种生化物质状态，防止细胞死亡后出现自溶分解。
3、使细胞中蛋白质、脂肪Βιβλιοθήκη Baidu糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前形态。
4、固定细胞形态，防止其变形或破裂。 5、使组织内各种物质产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 6、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。
9、放大倍率小。
荧光常见基础术语：
荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线， 即荧光。受激发后能产生荧光的物质称为荧光物质或荧光素。 激发光：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。
荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI，DAPI）、标有荧光素的特异性蛋白结
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落；
（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 （4）PBS的PH和离子强度的使用和要求，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。 （中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解； 低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）
9、拍照：
封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度； 正确使用荧光显微镜，防止紫外线对眼睛的损害； 检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减 弱；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h； 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。后欲再启用 时，须待灯光充分冷却后才能点燃，一天中应避免数次点燃光源，关闭汞灯至少在 开启15-30分钟后； 时效性：标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯 塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发； 使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须 保证镜油为无荧光镜油； 电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
4、一抗孵育条件：
在免疫荧光实验中最重要，包括孵育时间和抗体浓度； 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳； 孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后 37度复温45min； 具体条件还要摸索。
6、复染： 目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位；
根据实验方法分类： 直接法 间接法 补体法 其他
补体法：
利用补体反应，通过形成 抗原-抗体-补体复合物发射荧光。
其他免疫荧光技术：
时间分辨免疫荧光分析 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨免疫荧光测定
时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术， 它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，
【固定液的选择】
2、冰冻切片制备：
建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。 选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。 3、血清封闭： 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致） 封闭，减弱背景着色。 封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低 背景。 血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。