细胞免疫荧光技术ppt课件
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免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
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2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
免疫荧光技术概要课件
-
24
2.改良法
（1）试剂配制：
①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、 Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml 蒸馏水中，校定pH值至9.0。
②0.5mol／LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol／LNa2CO3（5.3％）10ml加入0.5mol ／L NaHCO3（4.2％）90ml，混合后，校定 pH值至9.0。
与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫
碳氨基键, 结合成为标记荧光免疫球蛋白, 即荧 光抗体。1个IgG分子上最多能标记15~20个 FITC分子。
-
15
2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rhodamine isothcyanate, TRITC) 是一种紫 红色粉末, 较稳定, 是罗达明(Rhodamine) 的衍生物, 易溶于水。最大吸收光谱为 550nm, 最大发射光谱为620nm, 呈橙红色 荧光, 与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。 经常用于双标记染色, 使用较多。
⑤荧光素容易溶解, 溶解后不会和其他 物质发生化学反应。
⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明, 能清晰判断结果。
-
13
二、可用于标记抗体的荧光素
用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到 目前为止有以下几种。
-
14
1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien isothiocyanate, FITC） 纯品为黄色粉末, 有两种异构体, 易溶于 水和乙醇等溶剂, 在溶解状态下呈黄绿色荧光。 性质稳定, 低温干燥下可保存多年, 室温下也可 保存两年以上。FITC分子质量为390u, 最大吸 收光谱为490～495nm, 最大发射光谱为520～ 530nm, 呈现明亮的黄绿色荧光。其中异构体I型 荧光效率更高, 与蛋白质结合更稳定。其结构式, 在碱性条件下, FITC的异硫氰酸基在水溶液中
细胞免疫荧光技术-PPT课件
二，高背景
可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
三，细胞/组织的形态被破坏
Hela细胞 细胞培养皿
仪器：
荧光显微镜
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
必要时用恒温摇床摇洗
ห้องสมุดไป่ตู้
免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
免疫荧光组化技术PPT课件
详细描述
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
医学免疫学检验免疫荧光技术课件
成本较高
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
免疫荧光技术的原理分类及应用 ppt课件
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
荧光的产生
• 物质吸收外界能量进入激发状态，再 回到稳定基态时，多余的能量会以电 磁辐射的形式释放，即发出荧光，这 类物质被称为荧光素。
• 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ——荧光免疫技术
由化学反应引起的荧光，为化学荧光 ——化学荧光技术
荧光素的荧光特性
• 采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的 疝灯），照射样品后即短暂的熄灭
• 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底 荧光衰退后，再测镧系荧光。
• 镧系元素具有较长的荧光寿命，延缓测量 时间，能有效地消除非特异本底荧光 (10ns)的干扰
• 镧系螯合物的的激发光与荧光发射峰之间 的波长差异，有利于排除非特异性荧光干 扰，提高检测特异性。
免疫荧光技术的主要优缺点
• 优点：特异性强、敏感性高、速度快 • 缺点：存在非特异性染色，结果判定
的客观性不足，技术程序也较复杂
根据实验方法分类
• 直接法 • 间接法 • 补体法 • 其他
标记抗体 抗原
直接法
荧光 • 将荧光标记的特异性 抗体（抗原）直接加 在抗原（抗体）上， 经一定的温度和时间 染色，水洗-干燥-封 片-镜检
在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较 为常用，所以一般通称为荧光抗体技术
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• 停止供能，荧光现象随即终止
• 对光的吸收和荧光的发射具有高度的选择 性 发射光的波长>入射光波长
荧光的产生
• 物质吸收外界能量进入激发状态，再 回到稳定基态时，多余的能量会以电 磁辐射的形式释放，即发出荧光，这 类物质被称为荧光素。
• 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ——荧光免疫技术
由化学反应引起的荧光，为化学荧光 ——化学荧光技术
荧光素的荧光特性
• 采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的 疝灯），照射样品后即短暂的熄灭
• 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底 荧光衰退后，再测镧系荧光。
• 镧系元素具有较长的荧光寿命，延缓测量 时间，能有效地消除非特异本底荧光 (10ns)的干扰
• 镧系螯合物的的激发光与荧光发射峰之间 的波长差异，有利于排除非特异性荧光干 扰，提高检测特异性。
免疫荧光技术的主要优缺点
• 优点：特异性强、敏感性高、速度快 • 缺点：存在非特异性染色，结果判定
的客观性不足，技术程序也较复杂
根据实验方法分类
• 直接法 • 间接法 • 补体法 • 其他
标记抗体 抗原
直接法
荧光 • 将荧光标记的特异性 抗体（抗原）直接加 在抗原（抗体）上， 经一定的温度和时间 染色，水洗-干燥-封 片-镜检
在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较 为常用，所以一般通称为荧光抗体技术
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• 停止供能，荧光现象随即终止
• 对光的吸收和荧光的发射具有高度的选择 性 发射光的波长>入射光波长
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
相关主题
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有机(醇类)固定剂
.
17
➢ 组织固定不充分,自发裂解
➢ 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例;
将组织切得较小
.
16
四，染色不正确
可能的原因
➢ 固定方法对于抗原不合适 ➢ 抗原修复方法不合适 ➢ 没有及时固定引起抗原的扩散
相应的措施
➢ 尝试不同的固定剂或增加固定时间 ➢ 尝试改变抗原修复条件 ➢ 立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换
.
10
思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
.
11
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
细胞免疫荧光技术
.
1
实验目的
➢ 掌握免疫荧光技术的基本原理 ➢ 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 ➢ 了解在免疫细胞化学技术中如何
获得好的实验结果
.
2
实验原理
➢ 原位检测 ➢ 抗原抗体特异反应 ➢ 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞
间接荧光抗体染色法示意图
.
3
实验用品
试剂：
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
仪器：
荧光显微镜
.
4
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
.
5
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
ห้องสมุดไป่ตู้
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
.
15
可能的原因
相应的措施
➢ 抗原修复方法过于剧烈
➢ 预实验摸索合适的修复条件
➢ 组织切片从玻片上脱落
➢ 增加固定时间;烤片;
使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
➢ 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 ➢ 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
➢ 组织形态难以分辨
➢ 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水
.
12
二，高背景
.
13
可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
.
14
三，细胞/组织的形态被破坏
必要时用恒温摇床摇洗
.
8
免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术
.
9
免疫细胞化学技术注意事项
➢ 选择合适的方法 ➢ 材料要留好 ➢ 选择抗体 ➢ 选择标记酶 ➢ 封闭液的选择 ➢ 设定对照实验
PBS 洗涤
PBS 洗涤
4℃过夜
37℃1-2小时 37℃5-10min 荧光显微镜 观察
.
6
实验结果
三，观察
human HeLa cells
.
7
实验中应注意的问题
➢ 细胞不要铺的过密:60-70%
➢ 防止细胞污染 ➢ 固定时间不要太长,一般10-30min ➢ TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 ➢ 选择合适的封闭液 ➢ 二抗孵育后,一定要洗干净
.
17
➢ 组织固定不充分,自发裂解
➢ 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例;
将组织切得较小
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四，染色不正确
可能的原因
➢ 固定方法对于抗原不合适 ➢ 抗原修复方法不合适 ➢ 没有及时固定引起抗原的扩散
相应的措施
➢ 尝试不同的固定剂或增加固定时间 ➢ 尝试改变抗原修复条件 ➢ 立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换
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思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
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疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
细胞免疫荧光技术
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1
实验目的
➢ 掌握免疫荧光技术的基本原理 ➢ 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 ➢ 了解在免疫细胞化学技术中如何
获得好的实验结果
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2
实验原理
➢ 原位检测 ➢ 抗原抗体特异反应 ➢ 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞
间接荧光抗体染色法示意图
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3
实验用品
试剂：
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
仪器：
荧光显微镜
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4
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
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5
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
ห้องสมุดไป่ตู้
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
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可能的原因
相应的措施
➢ 抗原修复方法过于剧烈
➢ 预实验摸索合适的修复条件
➢ 组织切片从玻片上脱落
➢ 增加固定时间;烤片;
使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
➢ 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 ➢ 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
➢ 组织形态难以分辨
➢ 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水
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二，高背景
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可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
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三，细胞/组织的形态被破坏
必要时用恒温摇床摇洗
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8
免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术
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免疫细胞化学技术注意事项
➢ 选择合适的方法 ➢ 材料要留好 ➢ 选择抗体 ➢ 选择标记酶 ➢ 封闭液的选择 ➢ 设定对照实验
PBS 洗涤
PBS 洗涤
4℃过夜
37℃1-2小时 37℃5-10min 荧光显微镜 观察
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6
实验结果
三，观察
human HeLa cells
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7
实验中应注意的问题
➢ 细胞不要铺的过密:60-70%
➢ 防止细胞污染 ➢ 固定时间不要太长,一般10-30min ➢ TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 ➢ 选择合适的封闭液 ➢ 二抗孵育后,一定要洗干净