免疫荧光技术课件

② 0 . 5 ml 蛋 白 ( 2 mg／m1)100mmol／L PBS( 含有 100mmol／L NaCl pH7.4)，加入 2.6ml SPDP 甲醇液， SPDP／蛋白＝ 9.5 ， 22 ℃ 40min，加入 25mmol／L 二硫苏糖醇 (DTT) pH7.4 缓冲液， 22 ℃ 25min，同上过 sephadex G—25，收集蛋白A峰。 ③取0.77mg／m1的PE和0.27mg／ml蛋白A 等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备 用，以上两种PE标记制品，可最后溶于 0.01mol／L pH7.4PB(含有0.1mol／LECTA、 lmol／L碘乙胺、1％BAS和0.1％NaN3)，0— 5℃保存。
二、荧光产生的原理

分子都含有电子，电子在不断地运动 着。根据量子理论，运动着的电子可以 处于一系列不连续的能量状态（即能级） 中，电子遵守一定的规则，可以从一个 能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能 级差相对应的特定能量的吸收或释放。 一般情况下，电子总是处于能量最低的 能级（即基态）。

在一定的条件下，电子可吸收能量 （如光能，热能，电能，机械能等）跃 迁到较高能量级（即激发态），这个过 程叫激发。处于激发态的电子是不稳定 的，它总是要跃迁回到基态，并将多余 的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射 跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射 跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐 射方式跃迁时，能量转化成相应波长的 光，这个过程叫发射。
2、改良法 （1）试剂配制： ①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、 Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸 馏水中，校定pH值至9.0。 ②0.5mol／LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取 0.5mol／LNa2CO3（5.3％）10ml 加入 0.5mol ／L NaHCO3（4.2％）90ml，混合后，校定 pH值至9.0。 ③3％重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水 碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水即成。
免疫荧光技术
Coons和Coworkers（1941）通过荧 光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察 荧光的发光物质，而建立了该项技术， 人们在Coons等的基础上发展完善了这一 技术。尤其是近年来，与激光技术、电 子计算机、扫描电镜和双光子显微镜等 技术结合发展为定量免疫荧光技术；荧 光激活细胞分类器（FACS）的应用，激 光共聚焦显微镜的问世，使这门技术发 展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术 的新领域。

（1）试剂配制： ①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于 2000ml蒸馏水中，校定pH值至9.0。 ② 0.5mol／LpH9.0 碳酸盐缓冲液配法： 取 0 . 5 mol／LNa2CO3（5.3％）10ml 加 入 0.5mol／L NaHCO3（4.2％）90ml，混合 后，校定pH值至9.0。 ③3％重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无 水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水即 成。

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方 法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标 记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光 抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术， 以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技 术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗 原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组 织）化学技术。免疫荧光细胞化学分直 接法、间接法和补体法以及与亲和化学 物质标记荧光素的方法，例如：SPA荧 光素标记物，生物素与卵白素、植物血 凝素荧光素标记物等。


（吸收光的光量子数）

荧光强度（即发射荧光的光量子数） 和激发光（吸收的光量子数）的强度有 关，激发光越强，荧光也越强。荧光素 可以发射红、橙红、黄、绿及蓝色等荧 光。光的强弱也与溶解荧光素的pH值、 浓度、染色时间和温度等条件有关。
荧光素的种类很多，但用于标记抗体 的荧光素，不同于一般荧光色素，它必 须具备以下条件： ①应具有与蛋白质分子形成共价键的 化学基因，结合后不易理解，而未结合 的色素及其降解产物容易排除。 ②荧光效率高，与蛋白质结合荧光效 率下降不多。

2. PE-IgG制备 异双功能试剂SPDP— [N-succinimdyl 3-（2-pyridyldlthio） propi-nate] 30μ g（1.1mg／m1）的乙醇 溶液，加入700ml的4.2mg／ml lgG PB溶 液（50mol／LpH7.5），在室温中反应 2.5h。再加入巯基化PE400ml（1.7mg／ m1）加到500μ l反应混合液中，室温反 应12h，加入100ml的50mmol／L碘乙酸 封闭残余巯基，用PB透析4℃过夜。加入 0.01％NaN3分装，4℃保存半年。


分别以1mgFITC溶于2份lml 0.5mol／L。 碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和 pH9.0）， 于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG 生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分 为两半。一半保留于2℃下，另一半置 25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通 过Sephadex G-25去游离FITC，由此计算 出 5mg家兔IgG结合的FITC量。

用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到 目前为止有以下几种。

1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien isothiocyanate， FITC） 纯品为黄色粉末，有两种异构体，易溶 于水和乙醇等溶剂，在溶解状态下呈黄绿色荧 光。性质稳定，低温干燥下可保存多年，室温 下也可保存两年以上。FITC分子质量为390u， 最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其中异 构体I型荧光效率更高，与蛋白质结合更稳定。 其结构式，在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基 在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺 化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光免疫 球蛋白，即荧光抗体。1个IgG分子上最多能标 记15~20个FITC分子。


标记方法如下：
1. 巯基化藻红蛋白（phycoerthrin，PE） 的制备 600μ 1的15.5mg／m1盐酸巯醇亚 胺 （iminothiolane hydrochloride）加到 1.2ml的 3.6mg／m1的PE中，和1.2ml PB （pH6.8）混合，装入透析袋置人50mmol ／L pH6.8 PB中透析，4℃过夜，再换用 pH7.5 PB透析6h。每个PE分子中可结合8 个巯基。
一、荧光色素
能够产生荧光并能作为染料的化合物 称为荧光色素，荧光色素必须具备吸收 激发光的光能并发射荧光，具有吸收一 定频率光能的生色团和能产生一定光亮 子的荧光团。吸收的光能转变为荧光的 百分数称为“荧光效率”。荧光效率与 发射荧光量子的数值成正比。 荧光效率（%）= （发射荧光的光量子数）× 100

4.其他荧光素 如4-乙酰胺-4-异硫氰酸2-硫酸（SITS）呈蓝色荧光；得克萨斯 红（Texas red）、藻红素R （phycoerythrin-R）、花青（cyanine， Cy2，Cy3，Cy5）等。
第三节 荧光素标记抗体的方法
一、标记方法：


采用FITC标记抗体的方法
常用Marsshall（1958）法标记荧光抗 体，也可以根据条件用Chadwick等 （1960）标记Βιβλιοθήκη Baidu或Clark等（1963）的透 析标记法。
3.PE-标记蛋白A方法 ①取4.08mgPE溶于0.1mol／ LpH7.4PB(含0.1mol／LNacl)lml中，溶解 后，取出0.5ml，再加入10ml SPDP无水 甲醇液(2.6mg／ml)，SPDP／蛋白摩尔值 为10，22℃反应5min，过SephadexG— 50(1×17cm)，用100mmol／L pH7.4 PBS(含 0.1mol／L NaCl)平衡和洗脱。

③结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合应无毒性，附加抗原性小。 ④与蛋白质结合的方法简便而快速， 结合物在一般条件下稳定。 ⑤荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。 ⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。

二、可用于标记抗体的荧光素

藻红蛋白及标记方法

藻红蛋白或称藻胆色素蛋白，他存 在被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿 素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋 白吸收光能，吸收后转化成能量，供其 发育、生长。当藻红蛋白被分离和纯化 后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能 吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光， 此时不再接受任何外来的光，也不能转 移光能。

跃迁到激发态的电子，大多处于单重 激发态。如果电子直接从单重激发态以 辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态 很不稳定，半衰期很短，发射持续的时 间也很短，这种发射光叫荧光，其寿命 较短。 1838年Brewster首先描述了荧光 现象，但荧光一词，是由 Stokesl852年 提出的。
第二节 荧 光 素

②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白 质总量，按每毫克蛋白加 0.01mg 荧光色 素，用天平准确称取所需的异硫氰酸荧 光素粉末。 ③结合（或标记）：边搅拌边将称取 的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避 免将荧光素粘于三角烧瓶或搅拌玻棒上 （大约在5~10min内加完），加完后，继 续搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶 液与4℃左右。结合完毕后，将标记的球 蛋白溶液离心（2 500r／min）20min，除 去其中少量的沉淀物。

④透析：装入透析袋中再置于烧杯中 用 pH8.0的缓冲盐水透析（0~4℃）过夜。 ⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过 葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）或G50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧 光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol／L 磷酸盐缓冲液（pH7.2）；过滤量：12ml 标记全球蛋白液（过滤前未透析）；收 集量：20ml（解析1.7倍）。
1、Marsshall法： （1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol ／LpH9.0的碳酸盐缓冲液、无菌生理盐 水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、 三角烧瓶（25～50m1）、冰及冰槽（或 1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、 透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500m1）、 pH7.2或8.0的0.01mol／LPBS等。

3. 四乙基罗达明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐红 色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为 596～600nm，呈橙红色荧光。因为 RB200比较低廉，广泛用于染色和双标 记示踪或染色。RB200不能直接和蛋白 质结合，要先经五氯化磷（PCI5）作用 下转变成黄酰氯（S02C1），在碱性条件 下易与赖氨酸s氨基反应而结合在蛋白分 子上。其分子质量为580u。

藻红蛋白利用共价键结合的形式与免疫球蛋 白结合，形成稳定的复合物。应用其复合物进行 免疫荧光组化染色，进行定量和定性分析；也可 以应用藻红蛋白抗体结合物进行免疫荧光的双重 或多重染色。尤其是藻红蛋白的亚型可以发射不 同波长的荧光，例如 PE的发射波长为520~570nm， 吸收光谱为490～510nm，正好与FITC处于同一 的吸收和发射波长上，利用这一特点进行双重标 记，在荧光显微镜下，可同时观察到代表2种抗 原成分的不同颜色（亮绿色和橘红色），大大简 化了免疫荧光的双标。当然还可以和其他荧光素， 胶体金结合进行免疫荧光或流式仪的三重以上标 记。
第一节 免疫荧光技术的原理
一、免疫荧光技术的基本原理
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧 光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探 针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。 在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有 标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧 光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光 （黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组 织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位， 以及利用定量技术测定含量。

2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rhodamine isothcyanate，TRITC) 是一种 紫红色粉末，较稳定，是罗达明 (Rhodamine)的衍生物，易溶于水。最大 吸收光谱为 550nm，最大发射光谱为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的 黄绿色荧光对比鲜明。经常用于双标记 染色，使用较多。