细胞免疫荧光技术PPT课件

二，高背景
可能的原因
一抗或二抗的浓度过高 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 组织过于干燥 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
预实验摸索最佳浓度 一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) 在染色过程中避免组织干燥 用新鲜制备或购买的玻片进行实验
三，细胞/组织的形态被破坏
细胞免疫荧光技术
实验目的
掌握免疫荧光技术的基本原理 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 了解在免疫细胞化学技术中如何
获得好的实验结果
实验原理
原位检测 抗原抗体特异反应 பைடு நூலகம் 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞
间接荧光抗体染色法示意图
实验用品
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
PBS 洗涤
PBS 洗涤
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/22
试剂：
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
仪器：
荧光显微镜
4℃过夜
37℃1-2小时 37℃510min
荧光显微镜 观察
实验结果
三，观察
human HeLa cells
实验中应注意的问题
细胞不要铺的过密:60-70%
防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净
必要时用恒温摇床摇洗
免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/22
免疫细胞化学技术注意事项
选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶 封闭液的选择 设定对照实验
思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
无抗原 抗体失效 固定不充分 过度固定 抗原修复无效 不兼容的二抗和一抗 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
用原位杂交方法检测蛋白表达 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 增加固定时间或改用不同的固定剂 减少固定时间;抗原修复 增加修复时间或更换修复液 使用可以与一抗结合的二抗 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例;
将组织切得较小
四，染色不正确
可能的原因
固定方法对于抗原不合适 抗原修复方法不合适 没有及时固定引起抗原的扩散
相应的措施
尝试不同的固定剂或增加固定时间 尝试改变抗原修复条件 立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换
有机(醇类)固定剂
可能的原因
相应的措施
抗原修复方法过于剧烈
预实验摸索合适的修复条件
组织切片从玻片上脱落
增加固定时间;烤片;
使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
组织形态难以分辨
切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水
组织固定不充分,自发裂解