免疫荧光技术概要PPT课件

免疫荧光技术
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Coons和Coworkers（1941）通过荧 光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察 荧光的发光物质，而建立了该项技术， 人们在Coons等的基础上发展完善了这一 技术。尤其是近年来，与激光技术、电 子计算机、扫描电镜和双光子显微镜等 技术结合发展为定量免疫荧光技术；荧 光激活细胞分类器（FACS）的应用，激 光共聚焦显微镜的问世，使这门技术发 展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术 的新领域。
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二、荧光产生的原理
分子都含有电子，电子在不断地运动 着。根据量子理论，运动着的电子可以 处于一系列不连续的能量状态（即能级） 中，电子遵守一定的规则，可以从一个 能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能 级差相对应的特定能量的吸收或释放。 一般情况下，电子总是处于能量最低的 能级（即基态）。
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在一定的条件下，电子可吸收能量 （如光能，热能，电能，机械能等）跃 迁到较高能量级（即激发态），这个过 程叫激发。处于激发态的电子是不稳定 的，它总是要跃迁回到基态，并将多余 的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射 跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射 跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐 射方式跃迁时，能量转化成相应波长的 光，这个过程叫发射。
光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光
（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组
织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位， 以及利用定量技术测定含量。
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用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方 法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标 记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光 抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术， 以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技 术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗 原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组 织）化学技术。免疫荧光细胞化学分直 接法、间接法和补体法以及与亲和化学 物质标记荧光素的方法，例如：SPA荧光 素标记物，生物素与卵白素、植物血凝 素荧光素标记物等。
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3. 四乙基罗达明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐红
色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为 596～600nm，呈橙红色荧光。因为 RB200比较低廉，广泛用于染色和双标 记示踪或染色。RB200不能直接和蛋白 质结合，要先经五氯化磷（PCI5）作用 下转变成黄酰氯（S02C1），在碱性条件 下易与赖氨酸s氨基反应而结合在蛋白分 子上。其分子质量为580u。
①应具有与蛋白质分子形成共价键的 化学基因，结合后不易理解，而未结合 的色素及其降解产物容易排除。
②荧光效率高，与蛋白质结合荧光效 率下降不多。
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③结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合应无毒性，附加抗原性小。
④与蛋白质结合的方法简便而快速， 结合物在一般条件下稳定。
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跃迁到激发态的电子，大多处于单重 激发态。如果电子直接从单重激发态以 辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态 很不稳定，半衰期很短，发射持续的时 间也很短，这种发射光叫荧光，其寿命 较短。 1838年Brewster首先描述了荧光 现象，但荧光一词，是由 Stokesl852年 提出的。
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第二节 荧 光 素
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4.其他荧光素 如4-乙酰胺-4-异硫氰酸2-硫酸（SITS）呈蓝色荧光；得克萨斯 红（Texas red）、藻红素R （phycoerythrin-R）、花青（cyanine， Cy2，Cy3，Cy5）等。
在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺
化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光免疫
球蛋白，即荧光抗体。1个IgG分子上最多能标 记15~20个FITC分子。
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2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rhodamine isothcyanate，TRITC) 是一种 紫红色粉末，较稳定，是罗达明 (Rhodamine)的衍生物，易溶于水。最大 吸收光谱为 550nm，最大发射光谱为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的 黄绿色荧光对比鲜明。经常用于双标记 染色，使用较多。
⑤荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。
⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
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ห้องสมุดไป่ตู้
二、可用于标记抗体的荧光素
用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到 目前为止有以下几种。
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1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien isothiocyanate， FITC） 纯品为黄色粉末，有两种异构体，易溶
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一、荧光色素
能够产生荧光并能作为染料的化合物 称为荧光色素，荧光色素必须具备吸收 激发光的光能并发射荧光，具有吸收一 定频率光能的生色团和能产生一定光亮 子的荧光团。吸收的光能转变为荧光的 百分数称为“荧光效率”。荧光效率与 发射荧光量子的数值成正比。
荧光效率（%）= （发射荧光的光量子数）× 100
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第一节 免疫荧光技术的原理
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一、免疫荧光技术的基本原理
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，
先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧
光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探
针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有
标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧
（吸收光的光量子数）
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荧光强度（即发射荧光的光量子数） 和激发光（吸收的光量子数）的强度有 关，激发光越强，荧光也越强。荧光素 可以发射红、橙红、黄、绿及蓝色等荧 光。光的强弱也与溶解荧光素的pH值、 浓度、染色时间和温度等条件有关。
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荧光素的种类很多，但用于标记抗体 的荧光素，不同于一般荧光色素，它必 须具备以下条件：
于水和乙醇等溶剂，在溶解状态下呈黄绿色荧
光。性质稳定，低温干燥下可保存多年，室温
下也可保存两年以上。FITC分子质量为390u， 最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其中异 构体I型荧光效率更高，与蛋白质结合更稳定。 其结构式，在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基