革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图
临床细菌培养鉴定流程及报告.介绍
3．分离培养 ⑴一般培养: 用定量接种环或无菌微量 加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用 抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中 国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数， 35～37℃培养18～24小时。 (2)特殊培养: 对临床要求真菌、淋病奈 瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需 条件接种相应特殊培养基，放臵相应条 件下进行培养。
(三 ) 尿 尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖 而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的 尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液 中分离出细菌（排除污染因素）即为菌 尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。 根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂 肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性 还可出现前列腺炎。
1.尿中常见分离菌
⑵采血时间及采血量 采血培养应该尽量在使
用抗菌药之前进行，在24小时内采集2～3份血
培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视
为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒 战或体温高峰到来之前0.5～1小时，采集血液， 或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量8～ 10ml，儿童1～5ml。血液和肉汤之比1：5 ～1：
(2)标本采集 a.清洁中段尿 最好是晨尿，是临床上 最常留取尿标本的方法 b.耻骨上膀胱穿刺法 是评估膀胱内细 菌感染的“金标准” c.直接导尿法 d.小儿收集包 e.留臵导尿
(3)标本运送 标本采集后应及时送检， 2小时内进行接种，否则应臵4～8℃冰箱 保存，冷藏保存标本时间不得超过8小时。
(2)报告方式 初步报告：在分离出细菌后，进行革兰 氏染色，作出初步报告。 最终报告：有意义的阳性结果报告，应 报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。 无意义的阳性结果报告，报告菌落 数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯 培养或是混合菌生长。 阴性结果报告:应报告无菌生长和菌落计 数＜1000cfu/ml或 ＜100cfu/ml尿。
革兰氏阴阳性菌鉴别方法
革兰氏染色基本原理：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G--表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏阳性菌（G+）革兰氏阴性菌（G-）革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G--两大类群，常用的复染液是番红。
溶液配制：1.结晶紫染色液：(1)甲液：结晶紫2g，95%乙醇20ml。
革兰阳性菌的鉴定操作
根据溶血现象分类
⑴ α型溶血性链球菌 菌落周围有不透明溶血环。多为条 件性致病菌。 ⑵ β型溶血性链球菌 菌落周围形成 完全透明的无色的溶血环。致病力 强。 ⑶ γ型链球菌 不产生溶血素，菌 落周围无溶血环，也称为不溶血性 链球菌。无致病性，常存在于乳类 和粪便中，偶尔引起感染。
形态与染色
球形或卵圆形，直径0.6-1.0um，呈链状排列，短者2-8个 细菌组成，长者有20-30个细菌组成。部分幼龄培养物可见 到透明质酸形成的荚膜。
形态与染色
肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，多数菌种成双或呈短链 状排列；一般无芽孢，无荚膜，少数菌种有鞭毛，陈旧培养 物或在厌氧状态下有时呈革兰氏阴性。
生化反应 胆汁七叶苷试验（+） 6.5％NaCl生长试验（+） PYR试验（+） 血清学分类属D群
粪肠球菌
G+球菌
肠球菌属
触酶 －
七叶苷阳性、 6.5％Nacl阳性
5.β溶血菌落
5.葡萄糖发酵试验
阳性 则转为上一个步骤试验； 阴性 报微球菌属
5.API板条试验
小、黄色菌落；镜下呈四联、八叠排列细菌，则做葡萄糖发酵试验：
6.七叶苷NaCl试验 6.CAMP试验 6.杆菌肽试验
七叶苷试验（阴性或阳性）6.5％Nacl试验阴性： 1.α溶血，做Optochin试验：敏感且G+矛头状双球菌、脐窝状 菌落，则判断为肺炎链球菌（Optochin试验抑菌圈的直径 ≥14mm为阳性） 2.β溶血：2.1.杆菌肽试验敏感，则判断为A群链球菌 2.2.乳胶凝集或CAMP阳性，则判断为B群链球菌 2.3.其它上机 3.γ溶血 则上机
6.Optochin试验
七叶苷试验阳性6.5％Nacl试验阳性， 则判断为肠球菌属： 1.阿拉伯糖阴性、山梨醇阳性则判断为粪肠球菌 2.阿拉伯糖阳性、山梨醇阴性则判断为屎肠球菌
临微标本检验程序
一．临床常见兼性需氧革兰阳性球菌的简单鉴定流程图：革兰阳性球菌在空气中生长（+）（-）触酶厌氧球菌（+）（-）葡萄糖胆汁溶菌实验或奥扑托欣实验O F ( -) (+)微球菌葡萄球菌胆汁七叶泔肺炎链球菌DNA酶+ （-）血浆凝固酶D群链球菌溶血ɑ—+ 6.5% Nacl草绿色链球菌杆肽菌表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌新生霉素—S R —+马尿酸表葡腐生D群链球菌肠球菌属水解实验气球菌+ ——D群多糖抗原+ B群链球菌其他链PRY阴性球菌血清凝集牛链球菌D群链球菌抗原、形态排列+ _肠球菌属气球菌属注：杆菌肽试验的阳性结果是A群链球菌；由于排版设计不正式，因此打不出来，请同学们自己写上去!二．临床常见阴性球菌的简单鉴定程序：革兰阴性球菌空气中生长—+韦荣球菌属DNA酶_ +奈瑟菌属卡他布汉菌TM培养基上生长—+其他奈瑟菌ONPG 乳糖+ —解乳糖奈瑟菌葡萄糖麦芽糖+ —淋病奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌三．临床常见革兰阳性杆菌的简单鉴定程序：革兰阳性杆菌抗酸染色+—分枝杆菌属芽孢诺卡菌属+ —（气生菌丝）—+ 空气中生长动力+ —分枝杆菌属诺卡杆菌需氧芽孢梭状芽孢杆菌杆菌（慢生长）（快生长）结核分枝杆菌快速生长分枝杆菌+ —李斯特菌属空气中生长七叶甘（+）+ —触酶（+）葡萄糖发酵（+）MR（+）、VP（+）棒状杆菌属丙酸杆菌属丹毒丝菌属李斯特菌属糖发酵触酶（+）棒状杆菌丹毒丝菌属（G+ ，易脱色）四．临床常见革兰阴性杆菌的简单鉴定程序：革兰阴性杆菌—氧化酶+葡萄糖O/F 嗜血杆菌属葡萄糖O/FF O 军团菌属伯克霍尔德菌属 F O 肠杆菌科不动肝菌属色杆菌科窄食单胞菌气单胞菌假单胞菌属弧菌属无色杆菌邻单胞菌属金色杆菌巴斯德菌属不利用色杆菌属金氏杆菌属弯曲菌属不利用洛菲不动杆菌副百日咳鲍特菌产碱杆菌属腐蚀艾肯菌布鲁杆菌产碱假单胞菌鲍特菌属无色杆菌属四．血液及骨髓标本的细菌学检验：血液、骨髓标本硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养）硫乙醇酸钠肉汤（厌氧培养）培养瓶子每日观察培养瓶中细菌生长情况无细菌生长有细菌生长现象继续培养7天仍无生长现象分离培养涂片革兰染色羊血琼脂平板（需氧培养）羊血琼脂平板（需氧培养）巧克力琼脂平板（二氧化碳培养）厌氧血琼脂平板（厌氧培养）真菌培养盲目接种发涂片结果报告同时做初步药敏试验观察菌落形态涂片、染色观察发初步药敏结果报告无菌生长革兰阳性球菌革兰阴性杆菌触酶实验氧化酶实验、O-F实验、KIA、MIU 阴性报告生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验五．尿液标本的细菌学检验：尿液标本定量培养离心沉淀快速检验分离培养革兰染色抗酸染色直接计数菌落计数纯培养血琼脂平板麦康凯平板硝酸盐还原实验TCT试验菌落特征、涂片染色初步报告生化反应血清学鉴定初步报告初步报告药敏试验最终报告六．生殖道标本检验程序：生殖道标本细菌培养涂片检查其他检查革兰染色免疫荧光染色血平板衣原体抗原检测暗视野镜检巧克力平板衣原体分离培养镀银染色支原体培养基初步报告最终报告最终报告七．粪便标本的细菌学检验程序：粪便标本或肛拭子直接涂片检查需氧培养革兰染色单染色增菌培养直接分离动力观察及制动实验碱性胨水GN增菌液或亚硒酸盐增菌液SS平板副溶血性弧菌TCBS平板或麦康凯平板选择性其他碱性平板分离或中国蓝平板平板或EMB初步报告结果菌落形态菌落形态菌落形态血清凝集血清凝集生化反应生化反应生化反应最终结果报告八．呼吸道标本的检验程序：鼻咽拭子直接涂片检查常规检查白喉棒状杆菌培养百日咳杆菌培养革兰染色异染颗粒染色血平板血清斜面培养基鲍-金培养基巧克力平板鸡蛋培养基35℃3-5d麦康凯平板35℃8-10小时直接镜检35℃18-24小时菌落形态、涂片染色观察，初步报告初步报告亚碲酸钾血平板培养菌落形态、涂片染色生化反应、血清学鉴定九．痰液标本细菌学的检验程序：痰液及下呼吸道分泌物培养前处理肉眼观擦血平板巧克力平板麦康凯平板涂片染色观察普通培养CO2培养普通培养初步报告35℃18-24h 18-24h 35℃18-24h菌落形态和涂片染色生化反应、血清学鉴定、药敏试验最终报告十．脑脊液标本的细菌学检验：脑脊液标本革兰染色抗酸染色墨汁染色血平板巧克力平板罗-琴氏沙保弱培养基培养基显微镜镜检菌落、形态、生化、血清学鉴定药敏试验最终报告十一．脓液及穿刺的细菌学检验程序：脓液、创伤分泌物及穿刺液涂片需氧培养厌氧培养革兰染色血平板（巧克力平板）隔绝氧气运送抗酸染色EMB或麦康凯厌氧琼脂平板初步报告菌落观察涂片、染色、纯培养、生化反应最终报告十二．组织标本的细菌学检验程序组织标本涂片或印片组织捣碎或匀浆器组织包埋革兰染色组织悬液美蓝染色荧光染色涂片染色增菌培养初步报告分离培养菌落鉴定生化鉴定最终报告。
临床微生物学检验
出鉴定结果
粪便中细菌（肠道粪便菌）鉴定流程图
接种 24h MAC 无色、透明半透明菌落 KIA、MIU 可疑志贺菌 诊断学清 凝集 SS 中心黑色菌落 扁平无色半 透明蜡滴状 蓝绿 色 24h 米泔水样便
TCBS
黄色菌落
革兰染色 G-,鱼群排列的弧菌
疑似霍乱弧菌 疑似副溶血 上机 诊断学清 凝集
可疑沙门菌
涂片 固定 初染 经火焰固定
目的：1、杀死细菌；2、使菌体与玻片粘附 牢固；3、菌体蛋 白变性，易于着色。
使各成分着色
石碳酸复红溶液， 5min，水洗甩干
酸性酒精溶液， 2min，水洗甩干 亚甲基蓝溶液， 30s，水洗甩干
脱色
使各成分脱色，抗酸杆菌不易脱色
复染
镜检
复染各成分成蓝色
蓝色背景下，染成红色细长或略带弯曲的杆菌，并有分支趋向。
涂片 目的：1、杀死细菌；2、使菌体与玻片粘附牢 固；3、菌体蛋 白变性，易于着色。 使细菌各成分着色 其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地 加强染料与细胞的结合。 帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色 的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不 易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。 目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱 色菌进行比较。 革兰阴性菌 革兰阳性菌
干粉培养基 1.5ml超纯水 充分溶解 阴性孔加50ul 棉拭子于培养 瓶中搅动数次
石蜡油液封
每空吸取50ul
混匀
取出棉拭子， 弃去
置35-37℃温箱孵育24小时
观察结果
结果判断
沙眼衣原体抗原检测
• 检验原理：用抗衣原体脂多糖 单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆 抗体分别固定于固相硝酸纤维 素膜，并和胶体金标记的另一 抗衣原体脂多糖单克隆抗体及 其他试剂和原料制成，应用胶 体金免疫层析技术，采用双抗 体夹心的形式建立的衣原体检 测方法，用于女性宫颈和男性 尿道中沙眼衣原体抗原的检测。 结果判读
革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图
革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图一、临床常见革兰氏阳性球菌的鉴定%NaCL葡萄糖血清凝集分群②－②+/－草绿色链球菌D群链球菌血浆凝固酶肠球菌属气球菌属精氨酸－－革兰氏阳性球菌需氧培养溶血溶血①OP ①杆菌肽①胆汁七叶苷②胆汁七叶苷②CAMP ②③%NaCI ③胆汁七叶苷②－②－②＋③－③－③＋/－①＋②＋③＋均－A群 B群 D群其他链球菌肺炎链草绿色链 D群链球球菌气球菌属山梨醇 /坚忍肠球菌①阿拉伯糖②甘露醇③山梨醇－粪肠球菌屎肠球菌坚韧肠球菌表皮葡萄球菌（新生霉素S）腐生葡萄球菌（新生霉素R）+非肠球菌属乳糖马肠链球菌二、临床常见革兰氏阴性杆菌鉴定见图观察平板上菌落特征（特殊形态、漫延生长、拉丝、溶血、荧光、色素等）②— 革兰氏阴性杆菌 氧化酶（—） KIA 葡萄糖O/FO/-） 肠杆菌科 动力①苯丙氨酸②VP 试验②－ ②－②麦芽糖迅速分解 ③甘露醇④DNA 酶 （G-球杆菌）（25%氧化酶+）②＋ ②－ ③－ ③+ ④＋ ④－嗜麦芽窄 食单胞菌 洋葱伯克 霍尔德氏菌（93%氧化酶阳性）埃希菌属 变形杆属菌 克雷伯氏菌属志贺氏菌属 （漫延生长） （动力-） 沙门氏菌属 普罗威登氏菌属 沙雷氏菌属枸橼酸杆菌属 摩根摩根氏菌 （DNA 酶+） 迟缓爱德华菌 (吲哚+，尿素+， 哈夫尼亚菌属耶尔森氏菌属 糖醇反应差） （蜂房哈夫尼亚）（G-短小杆菌 肠杆菌属37℃动力（—）25℃动力（+） 尿素（+）4℃生长 糖醇分解/黄色素 阴沟肠杆菌聚团多源菌 产气肠杆菌 板畸肠杆菌革兰氏阴性杆菌 氧化酶（+） KIA 葡萄糖O/FO/-）弧菌科动力①嗜盐试验 ②肌醇 ③O/129敏感试验 ④TCBS 生长（端鞭毛）（菌落产生 亮黄色色素）莫拉氏菌 （G-球杆菌，SS 不生长， 菌落细小， 不分解任何糖类）①－ ①－ ①＋/－②－ ②＋ ②－ ④－ ④－ ④＋③R ③S/R ③S 气单胞菌属 邻单胞菌属 弧菌属 （76%有β溶血） （无β溶血）（周鞭毛， 蛋白胨肉汤 中以上不分解任何糖 类）三、临床常见革兰氏阳性杆菌鉴定革兰氏阳性杆菌 抗酸染色（18℃--20℃有动力，倒伞形，狭窄溶血环,H 202+）李斯特氏菌＋ －＋/－ ＋＋ － 普通血平板生长芽胞杆菌梭状 奴卡氏菌 （血平板呈粉末状 生长，菌落不易挑 起，有菌丝）（G+着色不匀，有异染 颗粒，毒力试验阳性， 结合临床症状考虑 是否为白喉棒状杆菌）红斑丹毒丝菌 （G 染色易脱色，H 2S+ 感染特征）丙酸杆菌棒状杆菌红斑丹毒丝菌糖分解/触酶。
革兰染色法实验报告图
革兰染色法实验报告图
表及结果分析
实验目的：
通过革兰染色法对细菌进行分类和鉴定。
实验器材和试剂：
细菌培养基、青霉素、高锰酸钾、甲醇、碘酒、干净的平面玻片、显微镜。
实验操作：
1. 用细菌培养基将待测细菌培养至富有营养的生长期。
2. 取一块干净平面玻片，在玻片上均匀涂抹一层待测细菌培养基。
平衡后用酒精火消毒。
3. 取一支革兰染色剂，将细菌涂片中的细菌覆盖上染色剂，停留1分钟。
4. 用清水冲洗干净，接着滴上碘酒。
停留1分钟。
5. 流水冲洗过滤，将甲醇滴到细菌涂片上，待颜色变浅后再次
用流动水冲洗过滤。
6. 晾干细菌涂片，取一支高锰酸钾，滴于细菌涂片上，制成干
片即可。
实验结果：
革兰染色法将细菌分为两类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰
阳性菌细胞壁表层为厚的胞壁，可在染色过程中吸收靛蓝染料溶液，看起来呈现紫色；而革兰阴性菌细胞壁表层薄，无法吸收靛
蓝染料溶液，染色后呈现红色。
实验结论：
通过本次革兰染色法实验，我们成功将细菌分为革兰阳性菌和
革兰阴性菌两类。
这种分类和鉴定方法可以较为准确地对细菌进
行鉴定，可广泛应用于医学和生物学等领域。
注：以上仅为范文，具体实验条件和结果请依据实验情况而定。
革兰阳性菌的鉴定操作
2、触酶阴性，可初步判断 为链球菌属和肠球菌属
Staphaurex胶乳凝集试验是一种鉴定 金葡菌的快速、简便的商品化直接凝集 试验。 基本原理是在纸板或玻片上滴加包被有纤维蛋 白原和IgG抗体的聚苯乙烯胶乳，然后用接种 环挑取待鉴定的新鲜培养物加入混匀出现凝集 块现象为阳性。
杆菌肽（Bacitracin）试验
CAMP试验
无乳链球菌
马链球菌 β 溶血
血清分群诊断： A、B、C、D、F、G
G+球菌 触酶 － 七叶苷：－或＋ 6.5％Nacl：－ γ BAP溶 血 上机 α Optochin试验
链球菌属
β
乳胶凝集或CAMP 阳 性 B群链球菌 其他上机
敏感
杆菌肽 敏 感 A群链球菌 G+矛头状双球菌 、脐窝状菌落 肺炎链球菌
小、黄色菌落；镜下呈四 联、八叠排列细菌 葡萄糖发酵 － 报微球菌属
+
24hβ溶 血
金黄色葡萄球 菌
上机
链球菌属
链球菌属概述
链球菌属（Streptococcus）是一群触酶实验阴 性、呈链状排列的革兰氏阳性球菌，广泛存在于 自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，可引起 各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、新生儿败血症 、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等 该菌属种类繁多，目前临床上仍沿用Lancefield 血清学方法分为A、B、C、D、E、F、G群，或根 据其在血平板上的溶血现象进行分类（β 溶血或完 全溶血、α 溶血或草绿色溶血、γ 溶血或不溶血）
无芽孢，无鞭毛，革兰染色阳性。
菌落特征： 生长在血琼脂平板或哥伦比亚血平板上的菌落圆形，表面光滑、灰白色、边缘 整齐、半透明，开始扁平以后中心塌陷，呈脐窝状，具体呈矛头状成双排列。 该菌Optochin敏感，胆汁溶菌试验阳性。
革兰氏染色步骤
革兰氏染色步骤
步骤
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1、涂片固定。
2、草酸铵结晶紫染1分钟。
3、自来水冲洗。
4、加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5、水洗，用吸水纸吸去水分。
6、加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7、蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。
干燥，镜检。
染色后，革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
细菌分类：
革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、
链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌
革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫
拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
革兰氏染色实验步骤
.；. 革兰氏染色一．实验流程：1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。
涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。
至此，革兰氏染色结束。
二．染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
备注：1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。
2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
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革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图一、临床常见革兰氏阳性球菌的鉴定
6.5%NaCL
触
葡萄糖
血清凝集
分群
②－②+/－
草
绿
色
链
球
菌
D
群
链
球
菌血浆凝固酶
DNA酶
肠球菌属气球菌属
精氨酸
＋－
＋－
革兰氏阳性球菌
需氧培养
溶血溶血溶血
①OP ①杆菌肽①胆汁七叶苷
②胆汁七叶苷②CAMP ②6.5NaCI
③6.5%NaCI ③胆汁七叶苷
②－②－②＋
③－③－③＋/－
①＋②＋③＋均－
A群B群D群其他
链球菌
肺炎链草绿色链D群链球
球菌
气球菌属
山梨醇
坚忍肠球菌
①阿拉伯糖②甘露醇③山梨醇
粪肠球菌屎肠球菌坚韧肠球菌
表皮葡萄球菌
（新生霉素S）
腐生葡萄球菌
（新生霉素R）
+
非肠球菌属
乳糖
甘露醇
马肠链球菌
—
二、临床常见革兰氏阴性杆菌鉴定见图
观察平板上菌落特征（特殊形态、漫延生长、拉丝、溶血、荧光、色素等）
②— 革兰氏阴性杆菌 氧化酶（—） KIA 葡萄糖O/F
O/-） 肠杆菌科 动力①苯丙氨酸②VP 试验②－ ②－
②麦芽糖迅速分解 ③甘露醇
④DNA 酶 （G-球杆菌） （25%
氧化酶+）②＋ ②－
③－ ③+
④＋ ④－ 嗜麦芽窄 食单胞菌 洋葱伯克 霍尔德氏菌
（93%氧化酶阳性）
埃希菌属 变形杆属菌 克雷伯氏菌属
志贺氏菌属 （漫延生长） （动力-） 沙门氏菌属 普罗威登氏菌属 沙雷氏菌属
枸橼酸杆菌属 摩根摩根氏菌 （DNA 酶+） 迟缓爱德华菌 (吲哚+，尿素+， 哈夫尼亚菌属
耶尔森氏菌属 糖醇反应差） （蜂房哈夫尼亚）
（G-短小杆菌 肠杆菌属
37℃动力（—）
25℃动力（+）
尿素（+）4℃生长 糖醇分解
/黄色素 阴沟肠杆菌聚团多源菌 产气肠杆菌 板畸肠杆菌
革兰氏阴性杆菌 氧化酶（+） KIA 葡萄糖O/F
O/-） 弧菌科
动力①嗜盐试验 ②肌醇 ③O/129敏感试验
④TCBS 生长 （端鞭毛）
（菌落产生 亮黄色色素）
莫拉氏菌 （G-球杆菌，
SS 不生长， 菌落细小， 不分解任何
糖类）
①－ ①－ ①＋/－ ②－ ②＋ ②－ ④－ ④－ ④＋
③R ③S/R ③S 气单胞菌属 邻单胞菌属 弧菌属 （76%有β溶血） （无β溶血）
（周鞭毛， 蛋白胨肉汤 中PH8.6以上
不分解任何糖 类）
三、临床常见革兰氏阳性杆菌鉴定
革兰氏阳性杆菌 抗酸染色
（18℃--20℃有动力，倒
伞形，狭窄溶血环,H 2
02+）
李斯特氏菌
＋ － ＋/－
＋
＋ － 普通血平板生长
芽胞杆菌
梭状 奴卡氏菌 （血平板呈粉末状 生长，菌落不易挑 起，有菌丝）
（G+着色不匀，有异染 颗粒，毒力试验阳性， 结合临床症状考虑 是否为白喉棒状杆菌）
红斑丹毒丝菌 （G 染色易脱色，
H 2S+ 感染特征）
丙酸杆菌
棒状杆菌
红斑丹毒丝菌
糖分解/触酶。