水蛭素基因植物表达载体的构建
多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达
凝血酶
Ｃｏ ｓ ｒｃ ｉｎＯ ｌ—Ｃｏ ｙＳｅ ｒ ｔ ｒ ｐ ｅ ｓｏ ｃｏ ｎ ｒｄｎ ｎ ｔｕ ｔ ｆ Ｍｕｔ ｏ ａ ｉ ｐ ｃｅ ｏ ｙＥｘ ｒ ｓ ｉｎＶｅ ｔ ｒ ｄ Ｈｉ ｉ ａ ｕ
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Ｔａｊ ｄＪ ｅ ００ ｏ ３ ｏ２ ｉ ｉ Ｍｅ ，Ｆｂ ２ １ ，Ｖ ｌ ８Ｎ ｎｎ
多拷贝水蛭 素基 因在毕赤酵母 中的分 泌型表达
马精 彩
摘要
曹 晓娜Байду номын сангаас
熊蔚 俐
李 敬华
左爱 军
孙
蓓
梁 东春
目的： 通过多拷贝克隆技术实现水蛭 素（ ｉ ｄｎ基 因在 巴斯德毕赤酵母 中的高效分泌表达 。 Ｈｒ ｉ） ｕ 方法 ： 利用基
Ｈ ｒｄｎ ｗ ｓ ｕｃｓ ｕｌ ｃｎｔ ｃｅ ｎ ａ ａａ ｌｏ ｃ ｔ ｇ ｅｏ ｂｎｎ ｉ ｄｎｅ ｃ ｎｌ， ｈｃ ａ ｃｎ ｒ ｅ — ｉ ｉ） ａ ｓｃｅｓ ｌ ｏｓ ｔ ａ ｄｗ ｓ ｐｂｅ ｆ ｅｒ ｉ ｃｍ ｉ ｔ ｒ ｉ ｉ ｔ ｗ ｉｈ ｓ ｏ ｆｍ ｄｒ ｕ ｆ ｙ ｕ ｒ ｄ ｃ ｓ ｅｎ ｒ ａ ｈｕ ｉ ｆ ｅ ｙ ｗ ｉ ｅ
因重组技术 ， ｐ Ｉ ９ Ｈｒｄｎ中扩增 —ａｏ— ｒｄｎ插入到载体 ｐ Ｏ １ 从 ＰＣ 一 ｉ ｉ ｕ ｆｃｒＨｉ ｉ ｕ Ａ ８５中， 并构建 ｐ Ｏ １一 仅 Ｈｒｄ ）多拷贝 Ａ ８５ （ 一 ｉ ｉ ｕｎ
水蛭素生物合成通路
水蛭素生物合成通路
水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，具有促进血管生成、抗坏死的作用，在治疗血栓疾病方面具有广阔的前景。
水蛭素的生物合成通路大致如下：
1. 通过递归PCR，根据医用水蛭（Hirudo medicinalis）头部水蛭素（HV-2）的氨基酸序列，合成水蛭素基因。
2. 将水蛭素基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体pIN-ompA-HI中，使其编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白A信号肽序列的下游。
3. 转化大肠杆菌DH 5α，筛选出重组体，通过PCR、限制酶切图谱和序列分析，确保合成的水蛭素基因与设计完全一致。
4. 在大肠杆菌中表达水蛭素基因，重组水蛭素（rHV-2）被分泌到细胞周质及培养基中。
通过上述通路，成功表达出水蛭素，并证明其具有明显抗凝血酶生物活性。
水蛭素的成功合成，为血栓疾病的治疗提供了新的思路和方法。
15898430_重组水蛭素的原核表达及分离纯化
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水蛭入药历史 悠 久!早 在 中 国 的 东 汉 及 西 方 的 培养基购自北京陆 桥 技 术 有 限 责 任 公 司(限 制 性 核
古希腊时期就有其入药的记载'水蛭中起治疗功效 酸内切酶 E5;#和 F";#&6)@QK 连接酶&胶回收
的主要成分为水蛭 素"H$>P"$-#!它 由 医 用 水 蛭 唾 液 试剂盒 均 购 自 A38:D公 司(V?D$-!;>88试 剂 盒 购 自
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水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达
水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达龙铟;刘家云;刘莉;王宗仁【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2006(027)008【摘要】目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.【总页数】4页(P673-676)【作者】龙铟;刘家云;刘莉;王宗仁【作者单位】第四军医大学,西京医院中医科,陕西,西安,710033;第四军医大学,西京医院检验科,陕西,西安,710033;第四军医大学,药学系药理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学,西京医院中医科,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达 [J], 马精彩;曹晓娜;熊蔚俐;李敬华;左爱军;孙蓓;梁东春2.人组织型纤溶酶原激活剂-水蛭素融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达 [J], 于爱平;石炳兴;董春娜;蒋中华;吴祖泽3.葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达 [J], 魏东升;段广东;钱江潮4.人骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及表达产物的生物活性分析(英文) [J], 刘继中;陈苏民;李毅;胡蕴玉;纪宗玲;杨彤涛5.水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌 [J], 毕群;黄仪秀;朱圣庚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
三种水蛭全基因组精细图谱构建及其抗凝血机制演化研究
三种水蛭全基因组精细图谱构建及其抗凝血机制演化研究水蛭(Leech)俗称蚂蟥,是环节动物门蛭纲动物的统称。
营外寄生生活,短暂寄生于鱼类、爬行类、哺乳类的体表,吸血为食;或取食软体动物。
其中吸血种类因在吸血过程中产生高效的抗凝血活性物质而被中、西医广泛应用于临床治疗血栓性疾病。
除水蛭素外,有多种抗凝血活性物质被报道。
但这些抗凝血活性物质的合成途径及其在水蛭演化中的形成过程并不清楚。
基因组包含了一个物种全部的遗传信息,是生物生命活动和演化研究的基础。
完整的基因组常被称为全基因组图谱,包括一个物种的全部基因序列,以及这些基因的数量、位置、功能,相互关联关系等信息。
构建物种的全基因图谱不仅能为研究基因的表达机理及演化模式奠定基础,而且通过将这些基因信息与其它物种的基因组进行比较基因组研究,能够揭示生物物种形成和生理机能演化的途径和机制。
但由于目前测序技术成本很高,图谱构建与分析都具有一定难度等原因,只有少数模式生物及与人类密切相关的生物进行了全基因组测序。
在水蛭中仅有分布于美国,取食软体动物的泽蛭(Helobdella robusta)的全基因组被报道。
中国药典收录的三种医用水蛭:日本医蛭(Hirudo nipponica),宽体金线蛭(Whitmania pigra),菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)都没有基因组数据。
对这些物种进行全基因组图谱构建与比较基因组分析,将有助于发现新的抗凝血物质、阐述其作用机制,同时可以探讨水蛭吸血习性的形成过程,为进化生物学和医学发展提供数据。
本研究应用了目前先进的三代长片段Pacbio sequel测序技术,二代Illumina测序技术获得DNA与RNA数据,对日本医蛭、宽体金线蛭、以及菲牛蛭的基因组进行组装、注释,及比较基因组分析。
研究结果如下:1、水蛭基因组数据获取、组装和注释本研究使用二代short-read Illumina测序分别获取了日本医蛭、宽体金线蛭、菲牛蛭12.43 Gb、12.34Gb、12.23Gb DNA序列数据,基于k-mer分布估测了基因组大小及杂合度。
水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达
水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂（leech derived tryptase inhibitor,LDTI）原核表达载体,并在大肠埃希菌［BL21(DE3)］中高效表达重组蛋白。
方法：以含有目的核酸序列的质粒为模板，通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列，构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28a LDTI重组质粒亚克隆，进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析，然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导，以Tricine SDS PAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。
结果：成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28a LDTI，并获得相应的融合蛋白；本实验证明， LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达，在温度为33℃，IPTG浓度为0.7 mmol，诱导时间为1 h，所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。
结论：成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达，为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。
【关键词】构建；原核表达；水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂［Abstract］Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli［BL21(DE3)］.Methods： A 141 bp fragment of the LDTI gene was amplified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene, then it was cloned into T vector.After amplified and digested with restricted enzyme, the target fragment was subcloned into plasmid pET28a, the recombinant plasmid was transferred into E.coli Jm109.The fragment was identified by restricted enzyme and nucleotide sequencing.The recombinant expression plasmid containing LDTI gene was transformed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression was induced by isopropyl B D thiogalactopyranoside(IPTG) and confirmed by Tricine SDS PAGE and Western blot. Results：The recombinant plasmid of pET28a LDTI was obtained by PCR and identified by sequencing.The target protein was expressed abundantly in E.coli BL21(DE3) and the yield of LDTI protein was accounted for approximately 15% of germ proteins after one hour′s induction by 0.7 mmol/L IPTG at 33℃. Conclusion：pET28a LDTI was successfully constructed and can highly express objective protein in BL21(DE3), which will further help to the bioactivity of LDTI studying.［Key words］ construction; prokaryotic expression; leech derived tryptase inhibitor类胰蛋白酶抑制剂（tryptase inhibitor,TPI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，具有稳定肥大细胞的作用［1］，对于肥大细胞介导的变态反应性疾病如哮喘、变应性鼻炎等有潜在的治疗作用。
新型水蛭素嵌合抗栓剂的构建表达与功能研究
牛晋阳 等： 新型水蛭素嵌合抗栓剂的构建表达与功能研究
３ ７
母电穿孔转化， 菌落 Ｐ Ｃ Ｒ 方法筛选， 及外源基因多拷贝 克隆的筛选， 我们在含 Ｇ ４ １ ８ （ １ ０ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ ） 平板上共获得 １ ３个克隆。随机挑选其中的重组克隆 Ｎ １作诱导表达， 具体操 作 按 Ｐ ｉ ｃ ｈ ｉ ａＥ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎＫ ｉ ｔ （Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ， Ｕ Ｓ Ａ ） 进行。 １ ． ２ ． ４ 嵌合水蛭素分离纯化 首先将发酵液离心， 上 清液超滤并收集透过液（ Ｍ ＷＣ Ｏ＝ ２ ０ ０ ０ ０ ） ， 加入蒸馏水 重复超滤， 合 并 透 过 液。透 过 液 超 滤 浓 缩 （ Ｍ ＷＣ Ｏ＝ ３ ０ ０ ０ ） ， 加入蒸馏水重复透析除盐， 最终浓缩至所需体 积， 将样品经 Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ． Ｆ分离后再经 Ｓ ｏ ｕ ｃ ｅ １ ５ Ｑ进一 步精制， 最终得到纯度达 ９ ７ ％以上的纯品。 １ ． ２ ． ５ 水蛭素嵌合抗栓剂对小鼠尾部血栓模型的疗 效实验 健康雄性昆明小鼠饲养于 １ ６～ １ ８ ℃ 条件下， 给药前 １ ｈ ， 小鼠背部皮下注射角叉菜胶 ４ ０ ｍ ｇ ／ 制成 血栓模型。血栓形成后， 小鼠腹腔注射生理盐水和水 蛭素、 水蛭素嵌合抗栓剂， 每１ ２ ｈ注射 １次， 连续 ７ ２ ｈ 。 分别于给药后 ２ ４ 、 ４ ８ 、 ７ ２ ｈ测定血栓形成的长度； 同时 从小鼠眼球取血 ０ ． ５ ｍ ｌ ， 测定 Ａ Ｐ Ｔ Ｔ 、 Ｔ Ｔ值。
按前述方法对发酵液进行前期浓缩处理后， 将其 上至用 ｐ Ｈ ３ ． ０的甘氨酸缓冲液（ ５ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） 平衡好的 Ｓ ＰＳ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ． Ｆ柱上， 用含 １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｃ ｌ 的ｐ Ｈ ３ ． ０的 甘氨酸缓冲液（ ５ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） 梯度洗脱， 见图 ２ 。收集目 的蛋白峰， 脱盐调整 ｐ Ｈ 后， 再将其上至用 ｐ Ｈ ６ ． ２的磷 酸缓冲液 （ ５ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） 平衡好的 Ｓ ｏ ｕ ｃ ｅ １ ５ Ｑ 柱上， 用含 １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｃ ｌ 的ｐ Ｈ ６ ． ２的磷酸缓冲液（ ５ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） 梯度 洗脱， 见图 ３ 。收集纯化好目的蛋白峰， 最终用 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ 分析纯度达 ９ ７ ％以上， Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ色谱图如图 ４所示。
水蛭素的全基因合成及克隆
２ ３ 水 蛭 素 全 基 因 克 隆 的 鉴 定 ．
将 上 面 获 得 的 克 隆 （ 质 粒 ｐ Ｓ ） 进 行 质 粒 提 含 Ｂ Ｈ３ ， 取 ， Ｓｃ 用 ａ Ｉ及 Ａｐ Ｉ双 酶 切 电 泳 显 示 有 ２ ０ｂ 的 片 段 ａ ４ ｐ （ ３ 。 为 进 一 步 验 证 该 克 隆 的 正 确 性 ， ｐ Ｓ序 列 ５’ 图 ） 以 Ｂ Ｇ ＧＡＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＴ ３’ 引 物 ， 行 ｐ Ｓ Ｃ Ｇ 为 进 Ｂ Ｈ３ 插 入 片 段 的 序 列 分 析 ， 序 结 果 同 原 设 计 顺 序 ， 明 质 粒 测 表 ｐ Ｓ Ｂ Ｈ３含 有 ２ ０ ｂ 的 水 蛭 素 全 基 因 序 列 。 ４ ｐ
ＣＴ ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴ ＡＴＴ ＡＣＴ ＣＣｃＧＧＧ
Ａｐ Ｉ ａ
下 爿 裁 邵 丹 为 化 学 台 成 的 赛 聚 棱 苷 畦 序 列
田 １ 音 ＿ 的 水 蠢 蠢 ＤＮＡ序 列 毫
２． 基 因 的连 接 及克 隆 ２ 水 蛭 素 全基 因 的 连 接 及 克 隆 战 略 如 图 ２所 示 。 经 化 学 合 成 的 ６个 片 段 ， 两 个 在 ４ ℃ 下 每 ５
列。
篁 蚴、 抚艇缸 拍 鼋 美 ｊ 查 篓 鼍 克 蔓 ． 键司 錾 ： 固 盒 隆 目 睦
中田 分 类 号 ： ８ ； ７ ２ Ｑ７ １ Ｒ９ ３ 文 ■标 识码 ： Ａ
文 章 ■号 ：０ ０—７ ９ （ ０ ０）４—０ ５ １０ ０ １２ ０ ０ ０ ８—０ ４
水蛭 素是 由 ６ ５个 氨 基 酸 组 成 的 活 性 多 肽 ， 氨 基 酸 解 译 为 相 应 的 密 码 子 时 ， 量 选 用 酵 将 尽
应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库
湖北生物科技职业学院学生毕业论文论文题目：应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库系别：生物工程系专业：生物技术及应用年级：0510 姓名：宁晓微学号：0501011018 指导老师：艾炎军2007年11月18日摘要水蛭索是水蛭中抗凝血蛋白质的一种，它对凝血酶有强烈抑制作用：水蛭索的三维构象与水蛭中作用于血小板糖蛋白Ⅱb—Ⅲ a的拈抗剂decorsin十分相似，而该拮抗剂是以RGD保守序列作为识别序列的。
本文试图通过水蛭素定向进化获得既抑制凝血酶又抑制血小板凝集的双功能抗凝剂。
因此，本文运用DNA改组技术，在重组反应中掺入含RGD基序的化学合成的寡聚核苷酸，得到水蛭素各种变异体基因，然后将此突变体基因片段插入噬菌质粒pCANTAB 5\ G8，转化大肠杆菌，建立水蛭索突变体噬菌体表面展示库。
建库后，分别用凝血酶和血小板对这个库进行亲和淘选，初步结果显示，在实验定向进化中可看出选出的突变体抗凝血酶活性与血小板结合能力都随着淘选而提高。
并且当一种选择压力消失时，在该压力下选择出的某性状也会随之减弱。
因此，在适宜选择条件下有希望从突变体库中选择出既抑制凝血酶又与血小板有结台能力的双功能水蛭素突变基因。
进一步的淘选工作和DNA测序鉴定工作正在进行中。
、关键词：水蛭素；DNA改组；亲和淘选。
目录摘要 (1)目录 (2)引言 (3)1材料和方法 (5)1.1材料 (5)1.1.1试剂和菌种 (5)1.1.2器材 (6)1.2方法 (6)1.2.1改组联合随机片段的插入 (6)1.2.2 pCANTAB 5V G8／HIndⅢ,BamHI大片段与水蛭素基因的连接 (8)1.2.3 构建水蛭素突变体库 (9)结论 (12)致谢 (15)参考文献 (16)引言水蛭是我国的传统中药，早在1800年前的《神农本草经>中就有记载。
中医认为水蛭有破血、逐瘀、通经等功效。
1884年Havcraft发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质。
表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途[发明专利]
![表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/df9083f4a300a6c30d229fe4.png)
专利名称：表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途专利类型：发明专利
发明人：何向锋,张锦林,施文
申请号：CN201710357861.9
申请日：20170519
公开号：CN107083366A
公开日：
20170822
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途，过继免疫细胞为人源免疫细胞，过继免疫细胞表达的重组水蛭素包括信号肽和水蛭素。
重组水蛭素的氨基末端连接上人源分泌表达信号肽，将其编码基因利用基因工程技术转染过继免疫细胞，回输患者后，在患者体内持续稳定表达重组水蛭素，发挥“微型细胞药厂”的作用。
如此，通过过继免疫细胞作为载体细胞，可在体内长期稳定表达重组水蛭素，有效解决水蛭素对制备纯度要求较高、半衰期短、经常注射患者依从性差等弊端。
申请人：何向锋
地址：226000 江苏省南通市崇川区晨苑小区7栋205
国籍：CN
代理机构：北京商专永信知识产权代理事务所(普通合伙)
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利用基因工程菌生产抗凝药物水蛭素工艺技术水蛭素hirudin是水蛭
利用基因工程菌生产抗凝药物水蛭素工艺技术水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。
水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。
在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。
研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。
它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。
水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。
在医药市场上，抗栓药物的需求与日俱增，但由于天然水蛭来源有限，各国医药界都将注意力集中在重组水蛭素的开发上。
美国、法国、瑞士、德国、英国、日本十多家生物技术公司和医院都在临床应用或研究重组水蛭素类多肽抗栓药物治疗血栓疾病的范围和疗效。
1998年底，德国首先上市重组水蛭素药物。
1999年英国也获批准上市。
目前己注册的国家有欧洲、美国、澳大利亚、新西兰、南非等十多个国家。
中国具有心血管疾病药物和肿瘤药物的巨大市场，水蛭素又是传统中药，因此重组水蛭素开发前景十分看好。
据估计，我国目前血栓病人约有2000万人，如果其中l00万人采用水蛭素治疗，每年共需300—500公斤。
国际上常用肝素作为抗凝药物，这类抗凝药物的使用已有60多年历史，需用量逐年增加。
美国70年代每年就有1000万病人使用肝素，大部分是手术后预防血栓的形成。
仅美国肝素的年用量就超过9000亿单位，约相当于6吨。
研究表明，水蛭素素在许多性能上都优于肝素，它用药量小，不引起出血，也不依赖于内源性辅助因子。
随着临床研究的广泛开展，重组水蛭素的应用范围不断拓宽，它的需求也会日益增大。
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图l 合成的水蛭素基因（hir ）
i g .l The gene of hirudi n
2. 2 表达载体pBil2l hir 的构建
根据设计的水蛭素DN 片段，采用 XbaI／SacI 双
1 —双酶切后的质粒pBI121 ；2 —未酶切的质粒pBI121 M. "DNA／~i ndIII mar ker ；3 —双酶切后的重组质粒pBI121 hir ；
4 - 未酶切的重组质粒pBI121 hir
图4 pBI121 和pBI121 hir 酶切后电泳结果 Fi g .4 The electrophoresis after zy mol hydrol ysis
张正奇T ，荣水连，胡 华，李新梅
（湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410082 ）
摘 要：在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下，根椐植物基因密码子选择偏向，对
水蛭素基因序列进行了改造. 在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、pol y（A）尾、 Xba I 和Sac I 双酶切位点. 将所合成序列与双元载体pBI121 重组，构建成pBI121 hir 植物 高效表达载体. 经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3 种方法鉴定，该载体构建成功.
菌中低. 可采用电激法提高pBI121 hir 在 LBA44 4 中的转化效率［8 ］.
参考文献
［1 ］ 李元. 基因工程药物［M］. 北京：化学工业出版社，2 2 ：211
-232 . LI Y. Genetically engi nneered phar maceutics［M］. Beiji ng ：che mical I ndustry press ，2 2 ：211 -232 .（I n chi nese ） ［2 ］ 莫炜，张艳玲，王龙生，等. 重组双功能水蛭素的发酵、纯化和
of pBI121 and pBI121 hir
3 ）测序鉴定：DNA 序列分析是鉴定重组质粒构建成
功与否的最可靠方法. 我们委托 Takara 公司对重组
质粒 pBI121 hir 进 行 了 测 序，测 序 结 果 表 明，在
pBI121 质粒中存在所合成的外源基因 hir ，其序列
与所设计序列完全一致. 此结果充分证实 pBI121
第34 卷 第3 期 2 0 0 7 年3 月
湖 南 大 学 学 报（ 自 然 科 学 版 ） Journal of ~unan uni versit y（Nat ural Sciences ）
文章编号：1000- 2472（2007 ）03- 0061- 03
水蛭素基因植物表达载体的构建!
Vol .34 ，No .3 Mar. 2 0 0 7
合在植物中高效表达，为用植物反应器来生产水蛭 素打下基础.
1 材料与方法
1. 1 材料 pBI121 表 达 载 体 购 自 武 汉 大 学 生 命 科 学 院；
p MD18 T 高 效 克 隆 载 体 由 上 海 博 亚 公 司 提 供； XbaI 内 切 酶 和 SacI 内 切 酶 购 自 Bi olabs 公 司， !DNA／~i ndIII 相 对 分 子 质 量 标 准 物 购 自 MBI 公 司；大肠杆菌 D~5! 由中南大学湘雅医学院提供， 根癌农杆菌 LBA4404 由湖南农业大学湖南省作物 基因工程重点实验室提供；卡那霉素（Km ）和链霉 素（Str ）购自湖南省医药公司. 1. 2 方法 1 .2 .1 水蛭素 DNA 的合成
酶切p MD lS T hir 质粒，电泳分离回收水蛭素hir 片
段. 同 时，用 XbaI／SacI 双 酶 切 pBIl2l 载 体，切 除
图2 重组质粒pBIl2l hir 构建图 i g .2 onstructi on of recombi nant pBIl2l hir plas mi d
Key words ：hirudi n ；vect or ；plant ；reco mbi nant
急性心肌梗死等血栓栓塞性疾病的死亡率很
高，对人们的生命和健康造成严重威胁. 据报道， 我国有1 300 多万人患有血栓病. 治疗这类疾病的 安全且有效的方法是溶栓治疗，因而许多医药学家 致力于溶栓药物的开发和应用研究［1 ］. 水蛭素是水 蛭唾液腺分泌的一种酸性多肽，抗凝血作用较肝素
（College of Che mistry and Che mical Engi neeri ng ，~unan uni v ，Changsha ，~unan 410082 ，Chi na ）
Abstract ：Accordi ng t o t he plant bi as i n codon chi oce ，t he hirudi n gene was reconstit uted ，t hen it was synt heted . The synt heted DNA seCuence was cloned i nto t he plant expressi on vect or pBI121 by reco mbi nant DNA technology ，so t he plant expressi on plas mi d pBI121 hir was constructed . The DNA seCuenci ng ，gel electrophoresis and anti bi otic screeni ng test show t hat t he constructi on is successf ul .
卡那霉素的 LB 培养基平板上，则只有那些含有转 化质粒的细胞才能生存并生长增殖. 将构建的植物 表达载 体 pBIl2l hir 转 化 大 肠 杆 菌 DH5!，并 用 Km 抗性 LB 平板筛选（图3 ）. 图3（a ）是用重组质粒 pBIl2l hir 转化的 E .coli DH5!，图3（b ）是用质粒 pBIl2l 转化的 E .coli Dl hir 转化的大肠杆菌在卡那霉素抗性 LB 平板上能形成菌落，证实 pBIl2l hir 植物表达 载体构建成功.
强几百倍，且不引起血小板减少，是目前最强的凝 血酶特异性抑制剂［2 ，3 ］，在处理诸如败血休克、动脉
粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、高血压、眼科以及
多种缺少抗凝血酶的疾病方面有巨大优越性和广阔
应用前景. 申同健等人工合成了水蛭肽基因，并在酵 母中表达. 周祥山等研究了用毕赤酵母来生产水蛭 素，为工业化生产水蛭素奠定了基础［4 ］. 李大力以 p ROKII 为载体，用根癌农杆菌介导，使水蛭素基因 在甘蓝中得以表达［3 ］. 作者根据植物基因密码子选 择偏向，对水蛭素基因进行改造，配以先导链和pol y （A）尾，构建了水蛭素基因植物表达载体，使之适
经扩增后用碱裂解法提取pBIl2l hir 质粒，取部分 所提质粒溶于l0 !L TE 溶液中，经 Xba I／Sac I 双 酶切后，电泳鉴定pBIl2l hir 质粒；其余 pBIl2l hir 质粒溶于无菌甘油中，分装后于-S0 C 保存.
pBIl2l 质粒上 T DN 区的 GUS 报告基因，保留 T DN 区的 Km 抗性基因、35S 启动子和 NOSter m. 终止 子等，电泳分离回收pBIl2l 大片段. 控制pBIl2l 大片 段与hir 片段的比例为l .7 l ，连接反应温度为l4 C， 采用T4DN 连接酶将hir 片段与pBIl2l 大片段进行 过夜连接，连接产物即为水蛭素植物表达载体pBIl2l hir ，其构建如图2 所示.
2. 3 表达载体pBil2l hir 的鉴定 重组质粒的鉴定方法有抗性筛选法、凝胶电泳
检测法和 DN 序列分析法. 我们用这3 种方法对 植物表达载体pBIl2l hir 进行了鉴定.
l ）抗性筛选法：pBIl2l 中含有编码卡那霉素抗 性的新霉素磷酸转移酶基因 NPTII（neo myci n phosphotransf erase ）. 当质粒导入大肠杆菌后，使大肠杆 菌也获得了相同的抗性，将此细菌培养物涂在含有
! 收稿日期：2006 04 26 基金项目：湖南省财政厅农业发展基金资助项目 作者简介：张正奇（1944 - ），男，湖南常宁人，湖南大学教授 T 通讯联系人，E- mail ：Zh73 "si na .co m
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湖南大学学报（自然科学版）
2007 年
在保持水蛭肽原氨基酸序列前提下，本室改造
了水蛭肽基因序列，并委托上海博亚公司合成且克
（a ）重组质粒pBI121 hir 转化 E .coli D~5!
（b ）质粒pBI121 转化 E .coli D~5! 图3 pBI121 重组前后的转化菌落图 LB 平皿，卡那霉素抗性，37 C ，12 h Fi g .3 The D~5!colony of pBI121 and pBI121 hir
隆于p MDlS T 高效克隆载体中，获得p MDlS T hir 质粒. l .2 .2 水蛭素植物表达载体的构建
用Xba I 和 Sac I 双酶切 p MDlS T hir 载体， 琼脂糖凝胶电泳［5 ］回收所合成的水蛭素 DN 片段 hir ；同时用 Xba I 和 Sac I 双酶切pBIl2l 质粒（切 除 GUS 报告基因），并用 T4DN 连接酶将切开的 pBIl2l 与hir 片段连接，得pBIl2l hir 植物表达载 体. 将所得质粒转化到用冷 a l 2 法制备的新鲜大 肠杆菌 DH5! 中，用 Km 平板筛选阳性亚克隆体，
2 结果与讨论
2. l 水蛭素 DNA 的设计 l ）载体的选择：在基因工程中，载体是一种携
带外源基因的工具，用它将外源 DN 片段送入生 物细胞中. 用于 DN 重组的载体很多［6 ］，本文选用 双元载体pBIl2l 作为植物表达载体.