水蛭素基因植物表达载体的构建
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of pBI121 and pBI121 hir
3 ）测序鉴定：DNA 序列分析是鉴定重组质粒构建成
功与否的最可靠方法. 我们委托 Takara 公司对重组
质粒 pBI121 hir 进 行 了 测 序，测 序 结 果 表 明，在
pBI121 质粒中存在所合成的外源基因 hir ，其序列
与所设计序列完全一致. 此结果充分证实 pBI121
经扩增后用碱裂解法提取pBIl2l hir 质粒，取部分 所提质粒溶于l0 !L TE 溶液中，经 Xba I／Sac I 双 酶切后，电泳鉴定pBIl2l hir 质粒；其余 pBIl2l hir 质粒溶于无菌甘油中，分装后于-S0 C 保存.
pBIl2l 质粒上 T DN 区的 GUS 报告基因，保留 T DN 区的 Km 抗性基因、35S 启动子和 NOSter m. 终止 子等，电泳分离回收pBIl2l 大片段. 控制pBIl2l 大片 段与hir 片段的比例为l .7 l ，连接反应温度为l4 C， 采用T4DN 连接酶将hir 片段与pBIl2l 大片段进行 过夜连接，连接产物即为水蛭素植物表达载体pBIl2l hir ，其构建如图2 所示.
2 ）电泳检测：从平板上挑取单菌落，在LB 液体 培养基中振荡培养，提取质粒 pBIl2l 和植物表达 质粒pBIl2l hir ，经XbaI／SacI 双酶切，进行琼脂糖
第3 期
张正奇等：水蛭素基因植物表达载体的构建
63
凝胶电泳，实验结果示于图4 . 由图4 可知，在3 bp 左右有一条带，该片段的大小与hir 基因大小相 符，表 明 合 成 的 水 蛭 肽 基 因 hir 片 段 已 重 组 于 pBI121 载体上.
强几百倍，且不引起血小板减少，是目前最强的凝 血酶特异性抑制剂［2 ，3 ］，在处理诸如败血休克、动脉
粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、高血压、眼科以及
多种缺少抗凝血酶的疾病方面有巨大优越性和广阔
应用前景. 申同健等人工合成了水蛭肽基因，并在酵 母中表达. 周祥山等研究了用毕赤酵母来生产水蛭 素，为工业化生产水蛭素奠定了基础［4 ］. 李大力以 p ROKII 为载体，用根癌农杆菌介导，使水蛭素基因 在甘蓝中得以表达［3 ］. 作者根据植物基因密码子选 择偏向，对水蛭素基因进行改造，配以先导链和pol y （A）尾，构建了水蛭素基因植物表达载体，使之适
1 —双酶切后的质粒pBI121 ；2 —未酶切的质粒pBI121 M. "DNA／~i ndIII mar ker ；3 —双酶切后的重组质粒pBI121 hir ；
4 - 未酶切的重组质粒pBI121 hir
图4 pBI121 和pBI121 hir 酶切后电泳结果 Fi g .4 The electrophoresis after zy mol hydrol ysis
卡那霉素的 LB 培养基平板上，则只有那些含有转 化质粒的细胞才能生存并生长增殖. 将构建的植物 表达载 体 pBIl2l hir 转 化 大 肠 杆 菌 DH5!，并 用 Km 抗性 LB 平板筛选（图3 ）. 图3（a ）是用重组质粒 pBIl2l hir 转化的 E .coli DH5!，图3（b ）是用质粒 pBIl2l 转化的 E .coli DH5!. 可见，pBIl2l 及重组 质粒 pBIl2l hir 转化的大肠杆菌在卡那霉素抗性 LB 平板上能形成菌落，证实 pBIl2l hir 植物表达 载体构建成功.
2. 3 表达载体pBil2l hir 的鉴定 重组质粒的鉴定方法有抗性筛选法、凝胶电泳
检测法和 DN 序列分析法. 我们用这3 种方法对 植物表达载体pBIl2l hir 进行了鉴定.
l ）抗性筛选法：pBIl2l 中含有编码卡那霉素抗 性的新霉素磷酸转移酶基因 NPTII（neo myci n phosphotransf erase ）. 当质粒导入大肠杆菌后，使大肠杆 菌也获得了相同的抗性，将此细菌培养物涂在含有
张正奇T ，荣水连，胡 华，李新梅
（湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410082 ）
摘 要：在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下，根椐植物基因密码子选择偏向，对
水蛭素基因序列进行了改造. 在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、pol y（A）尾、 Xba I 和Sac I 双酶切位点. 将所合成序列与双元载体pBI121 重组，构建成pBI121 hir 植物 高效表达载体. 经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3 种方法鉴定，该载体构建成功.
酶切p MD lS T hir 质粒，电泳分离回收水蛭素hir 片
段. 同 时，用 XbaI／SacI 双 酶 切 pBIl2l 载 体，切 除
图2 重组质粒pBIl2l hir 构建图 i g .2 onstructi on of recombi nant pBIl2l hir plas mi d
hir 植物表达载体构建成功.
2. 4 pBil2l hir 转化根癌农杆菌 LBA4404
采用 冻 融 法 使 pBI121 hir 转 化 根 癌 农 杆 菌
LBA44 4 ，然后用Str 和 Km 抗性的 YEB 平板划板
培养，所得LBA44 4 菌落较大肠杆菌的菌落少，表
明pBI121 hir 在 LBA44 4 中转化效率较在大肠杆
物基因密码子选择偏向［7 ］，在不改变原水蛭肽氨基
酸序列前提下，对水蛭素基因进行了改造（图l ）. 在 TG 前添加了引导链和 Xba I 酶切位点，配以 pol y（ ）尾，以提高水蛭肽在植物中的表达水平，采 用 T T G 串连终止码，使转录有效终止，并添 加了保护酶切位点和Sac I 酶切位点.
关键词：水蛭素；载体；植物；重组
中图分类号：78 ；R169
文献标识码：A
Constr ucti on of t he pl ant Expressi on pl as mi d f or ~ir udi n Gene
Z~ANG Zheng- Ci T ，RONG Shui-lian ，~u ~ua ，LI Xi n- mei
第34 卷 第3 期 2 0 0 7 年3 月
湖 南 大 学 学 报（ 自 然 科 学 版 ） Journal of ~unan uni versit y（Nat ural Sciences ）
文章编号：1000- 2472（2007 ）03- 0061- 03
水蛭素基因植物表达载体的构建!
Vol .34 ，No .3 Mar. 2 0 0 7
Key words ：hirudi n ；vect or ；plant ；reco mbi nant
急性心肌梗死等血栓栓塞性疾病的死亡率很
高，对人们的生命和健康造成严重威胁. 据报道， 我国有1 300 多万人患有血栓病. 治疗这类疾病的 安全且有效的方法是溶栓治疗，因而许多医药学家 致力于溶栓药物的开发和应用研究［1 ］. 水蛭素是水 蛭唾液腺分泌的一种酸性多肽，抗凝血作用较肝素
2 结果与讨论
2. l 水蛭素 DNA 的设计 l ）载体的选择：在基因工程中，载体是一种携
带外源基因的工具，用它将外源 DN 片段送入生 物细胞中. 用于 DN 重组的载体很多［6 ］，本文选用 双元载体pBIl2l 作为植物表达载体.
2 ）水蛭素 DN 的设计：外源基因在植物体内 的表达水平受启动子效率、5 ’端非编码区序列、转录 的有效终止和外源基因本身的结构等因素的影响. 为了使水蛭素基因在植物中高效表达，我们根据植
G GT T
T 源自文库 GG G TT G G G G TT
G G G G T TT T T G TG T T
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图l 合成的水蛭素基因（hir ）
i g .l The gene of hirudi n
2. 2 表达载体pBil2l hir 的构建
根据设计的水蛭素DN 片段，采用 XbaI／SacI 双
! 收稿日期：2006 04 26 基金项目：湖南省财政厅农业发展基金资助项目 作者简介：张正奇（1944 - ），男，湖南常宁人，湖南大学教授 T 通讯联系人，E- mail ：Zh73 "si na .co m
62
湖南大学学报（自然科学版）
2007 年
在保持水蛭肽原氨基酸序列前提下，本室改造
了水蛭肽基因序列，并委托上海博亚公司合成且克
隆于p MDlS T 高效克隆载体中，获得p MDlS T hir 质粒. l .2 .2 水蛭素植物表达载体的构建
用Xba I 和 Sac I 双酶切 p MDlS T hir 载体， 琼脂糖凝胶电泳［5 ］回收所合成的水蛭素 DN 片段 hir ；同时用 Xba I 和 Sac I 双酶切pBIl2l 质粒（切 除 GUS 报告基因），并用 T4DN 连接酶将切开的 pBIl2l 与hir 片段连接，得pBIl2l hir 植物表达载 体. 将所得质粒转化到用冷 a l 2 法制备的新鲜大 肠杆菌 DH5! 中，用 Km 平板筛选阳性亚克隆体，
合在植物中高效表达，为用植物反应器来生产水蛭 素打下基础.
1 材料与方法
1. 1 材料 pBI121 表 达 载 体 购 自 武 汉 大 学 生 命 科 学 院；
p MD18 T 高 效 克 隆 载 体 由 上 海 博 亚 公 司 提 供； XbaI 内 切 酶 和 SacI 内 切 酶 购 自 Bi olabs 公 司， !DNA／~i ndIII 相 对 分 子 质 量 标 准 物 购 自 MBI 公 司；大肠杆菌 D~5! 由中南大学湘雅医学院提供， 根癌农杆菌 LBA4404 由湖南农业大学湖南省作物 基因工程重点实验室提供；卡那霉素（Km ）和链霉 素（Str ）购自湖南省医药公司. 1. 2 方法 1 .2 .1 水蛭素 DNA 的合成
菌中低. 可采用电激法提高pBI121 hir 在 LBA44 4 中的转化效率［8 ］.
参考文献
［1 ］ 李元. 基因工程药物［M］. 北京：化学工业出版社，2 2 ：211
-232 . LI Y. Genetically engi nneered phar maceutics［M］. Beiji ng ：che mical I ndustry press ，2 2 ：211 -232 .（I n chi nese ） ［2 ］ 莫炜，张艳玲，王龙生，等. 重组双功能水蛭素的发酵、纯化和
（a ）重组质粒pBI121 hir 转化 E .coli D~5!
（b ）质粒pBI121 转化 E .coli D~5! 图3 pBI121 重组前后的转化菌落图 LB 平皿，卡那霉素抗性，37 C ，12 h Fi g .3 The D~5!colony of pBI121 and pBI121 hir
（College of Che mistry and Che mical Engi neeri ng ，~unan uni v ，Changsha ，~unan 410082 ，Chi na ）
Abstract ：Accordi ng t o t he plant bi as i n codon chi oce ，t he hirudi n gene was reconstit uted ，t hen it was synt heted . The synt heted DNA seCuence was cloned i nto t he plant expressi on vect or pBI121 by reco mbi nant DNA technology ，so t he plant expressi on plas mi d pBI121 hir was constructed . The DNA seCuenci ng ，gel electrophoresis and anti bi otic screeni ng test show t hat t he constructi on is successf ul .
T T G GT TTTTT
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T G T TG T G G T T GGT G
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3 ）测序鉴定：DNA 序列分析是鉴定重组质粒构建成
功与否的最可靠方法. 我们委托 Takara 公司对重组
质粒 pBI121 hir 进 行 了 测 序，测 序 结 果 表 明，在
pBI121 质粒中存在所合成的外源基因 hir ，其序列
与所设计序列完全一致. 此结果充分证实 pBI121
经扩增后用碱裂解法提取pBIl2l hir 质粒，取部分 所提质粒溶于l0 !L TE 溶液中，经 Xba I／Sac I 双 酶切后，电泳鉴定pBIl2l hir 质粒；其余 pBIl2l hir 质粒溶于无菌甘油中，分装后于-S0 C 保存.
pBIl2l 质粒上 T DN 区的 GUS 报告基因，保留 T DN 区的 Km 抗性基因、35S 启动子和 NOSter m. 终止 子等，电泳分离回收pBIl2l 大片段. 控制pBIl2l 大片 段与hir 片段的比例为l .7 l ，连接反应温度为l4 C， 采用T4DN 连接酶将hir 片段与pBIl2l 大片段进行 过夜连接，连接产物即为水蛭素植物表达载体pBIl2l hir ，其构建如图2 所示.
2 ）电泳检测：从平板上挑取单菌落，在LB 液体 培养基中振荡培养，提取质粒 pBIl2l 和植物表达 质粒pBIl2l hir ，经XbaI／SacI 双酶切，进行琼脂糖
第3 期
张正奇等：水蛭素基因植物表达载体的构建
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凝胶电泳，实验结果示于图4 . 由图4 可知，在3 bp 左右有一条带，该片段的大小与hir 基因大小相 符，表 明 合 成 的 水 蛭 肽 基 因 hir 片 段 已 重 组 于 pBI121 载体上.
强几百倍，且不引起血小板减少，是目前最强的凝 血酶特异性抑制剂［2 ，3 ］，在处理诸如败血休克、动脉
粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、高血压、眼科以及
多种缺少抗凝血酶的疾病方面有巨大优越性和广阔
应用前景. 申同健等人工合成了水蛭肽基因，并在酵 母中表达. 周祥山等研究了用毕赤酵母来生产水蛭 素，为工业化生产水蛭素奠定了基础［4 ］. 李大力以 p ROKII 为载体，用根癌农杆菌介导，使水蛭素基因 在甘蓝中得以表达［3 ］. 作者根据植物基因密码子选 择偏向，对水蛭素基因进行改造，配以先导链和pol y （A）尾，构建了水蛭素基因植物表达载体，使之适
1 —双酶切后的质粒pBI121 ；2 —未酶切的质粒pBI121 M. "DNA／~i ndIII mar ker ；3 —双酶切后的重组质粒pBI121 hir ；
4 - 未酶切的重组质粒pBI121 hir
图4 pBI121 和pBI121 hir 酶切后电泳结果 Fi g .4 The electrophoresis after zy mol hydrol ysis
卡那霉素的 LB 培养基平板上，则只有那些含有转 化质粒的细胞才能生存并生长增殖. 将构建的植物 表达载 体 pBIl2l hir 转 化 大 肠 杆 菌 DH5!，并 用 Km 抗性 LB 平板筛选（图3 ）. 图3（a ）是用重组质粒 pBIl2l hir 转化的 E .coli DH5!，图3（b ）是用质粒 pBIl2l 转化的 E .coli DH5!. 可见，pBIl2l 及重组 质粒 pBIl2l hir 转化的大肠杆菌在卡那霉素抗性 LB 平板上能形成菌落，证实 pBIl2l hir 植物表达 载体构建成功.
2. 3 表达载体pBil2l hir 的鉴定 重组质粒的鉴定方法有抗性筛选法、凝胶电泳
检测法和 DN 序列分析法. 我们用这3 种方法对 植物表达载体pBIl2l hir 进行了鉴定.
l ）抗性筛选法：pBIl2l 中含有编码卡那霉素抗 性的新霉素磷酸转移酶基因 NPTII（neo myci n phosphotransf erase ）. 当质粒导入大肠杆菌后，使大肠杆 菌也获得了相同的抗性，将此细菌培养物涂在含有
张正奇T ，荣水连，胡 华，李新梅
（湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410082 ）
摘 要：在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下，根椐植物基因密码子选择偏向，对
水蛭素基因序列进行了改造. 在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、pol y（A）尾、 Xba I 和Sac I 双酶切位点. 将所合成序列与双元载体pBI121 重组，构建成pBI121 hir 植物 高效表达载体. 经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3 种方法鉴定，该载体构建成功.
酶切p MD lS T hir 质粒，电泳分离回收水蛭素hir 片
段. 同 时，用 XbaI／SacI 双 酶 切 pBIl2l 载 体，切 除
图2 重组质粒pBIl2l hir 构建图 i g .2 onstructi on of recombi nant pBIl2l hir plas mi d
hir 植物表达载体构建成功.
2. 4 pBil2l hir 转化根癌农杆菌 LBA4404
采用 冻 融 法 使 pBI121 hir 转 化 根 癌 农 杆 菌
LBA44 4 ，然后用Str 和 Km 抗性的 YEB 平板划板
培养，所得LBA44 4 菌落较大肠杆菌的菌落少，表
明pBI121 hir 在 LBA44 4 中转化效率较在大肠杆
物基因密码子选择偏向［7 ］，在不改变原水蛭肽氨基
酸序列前提下，对水蛭素基因进行了改造（图l ）. 在 TG 前添加了引导链和 Xba I 酶切位点，配以 pol y（ ）尾，以提高水蛭肽在植物中的表达水平，采 用 T T G 串连终止码，使转录有效终止，并添 加了保护酶切位点和Sac I 酶切位点.
关键词：水蛭素；载体；植物；重组
中图分类号：78 ；R169
文献标识码：A
Constr ucti on of t he pl ant Expressi on pl as mi d f or ~ir udi n Gene
Z~ANG Zheng- Ci T ，RONG Shui-lian ，~u ~ua ，LI Xi n- mei
第34 卷 第3 期 2 0 0 7 年3 月
湖 南 大 学 学 报（ 自 然 科 学 版 ） Journal of ~unan uni versit y（Nat ural Sciences ）
文章编号：1000- 2472（2007 ）03- 0061- 03
水蛭素基因植物表达载体的构建!
Vol .34 ，No .3 Mar. 2 0 0 7
Key words ：hirudi n ；vect or ；plant ；reco mbi nant
急性心肌梗死等血栓栓塞性疾病的死亡率很
高，对人们的生命和健康造成严重威胁. 据报道， 我国有1 300 多万人患有血栓病. 治疗这类疾病的 安全且有效的方法是溶栓治疗，因而许多医药学家 致力于溶栓药物的开发和应用研究［1 ］. 水蛭素是水 蛭唾液腺分泌的一种酸性多肽，抗凝血作用较肝素
2 结果与讨论
2. l 水蛭素 DNA 的设计 l ）载体的选择：在基因工程中，载体是一种携
带外源基因的工具，用它将外源 DN 片段送入生 物细胞中. 用于 DN 重组的载体很多［6 ］，本文选用 双元载体pBIl2l 作为植物表达载体.
2 ）水蛭素 DN 的设计：外源基因在植物体内 的表达水平受启动子效率、5 ’端非编码区序列、转录 的有效终止和外源基因本身的结构等因素的影响. 为了使水蛭素基因在植物中高效表达，我们根据植
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图l 合成的水蛭素基因（hir ）
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2. 2 表达载体pBil2l hir 的构建
根据设计的水蛭素DN 片段，采用 XbaI／SacI 双
! 收稿日期：2006 04 26 基金项目：湖南省财政厅农业发展基金资助项目 作者简介：张正奇（1944 - ），男，湖南常宁人，湖南大学教授 T 通讯联系人，E- mail ：Zh73 "si na .co m
62
湖南大学学报（自然科学版）
2007 年
在保持水蛭肽原氨基酸序列前提下，本室改造
了水蛭肽基因序列，并委托上海博亚公司合成且克
隆于p MDlS T 高效克隆载体中，获得p MDlS T hir 质粒. l .2 .2 水蛭素植物表达载体的构建
用Xba I 和 Sac I 双酶切 p MDlS T hir 载体， 琼脂糖凝胶电泳［5 ］回收所合成的水蛭素 DN 片段 hir ；同时用 Xba I 和 Sac I 双酶切pBIl2l 质粒（切 除 GUS 报告基因），并用 T4DN 连接酶将切开的 pBIl2l 与hir 片段连接，得pBIl2l hir 植物表达载 体. 将所得质粒转化到用冷 a l 2 法制备的新鲜大 肠杆菌 DH5! 中，用 Km 平板筛选阳性亚克隆体，
合在植物中高效表达，为用植物反应器来生产水蛭 素打下基础.
1 材料与方法
1. 1 材料 pBI121 表 达 载 体 购 自 武 汉 大 学 生 命 科 学 院；
p MD18 T 高 效 克 隆 载 体 由 上 海 博 亚 公 司 提 供； XbaI 内 切 酶 和 SacI 内 切 酶 购 自 Bi olabs 公 司， !DNA／~i ndIII 相 对 分 子 质 量 标 准 物 购 自 MBI 公 司；大肠杆菌 D~5! 由中南大学湘雅医学院提供， 根癌农杆菌 LBA4404 由湖南农业大学湖南省作物 基因工程重点实验室提供；卡那霉素（Km ）和链霉 素（Str ）购自湖南省医药公司. 1. 2 方法 1 .2 .1 水蛭素 DNA 的合成
菌中低. 可采用电激法提高pBI121 hir 在 LBA44 4 中的转化效率［8 ］.
参考文献
［1 ］ 李元. 基因工程药物［M］. 北京：化学工业出版社，2 2 ：211
-232 . LI Y. Genetically engi nneered phar maceutics［M］. Beiji ng ：che mical I ndustry press ，2 2 ：211 -232 .（I n chi nese ） ［2 ］ 莫炜，张艳玲，王龙生，等. 重组双功能水蛭素的发酵、纯化和
（a ）重组质粒pBI121 hir 转化 E .coli D~5!
（b ）质粒pBI121 转化 E .coli D~5! 图3 pBI121 重组前后的转化菌落图 LB 平皿，卡那霉素抗性，37 C ，12 h Fi g .3 The D~5!colony of pBI121 and pBI121 hir
（College of Che mistry and Che mical Engi neeri ng ，~unan uni v ，Changsha ，~unan 410082 ，Chi na ）
Abstract ：Accordi ng t o t he plant bi as i n codon chi oce ，t he hirudi n gene was reconstit uted ，t hen it was synt heted . The synt heted DNA seCuence was cloned i nto t he plant expressi on vect or pBI121 by reco mbi nant DNA technology ，so t he plant expressi on plas mi d pBI121 hir was constructed . The DNA seCuenci ng ，gel electrophoresis and anti bi otic screeni ng test show t hat t he constructi on is successf ul .
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