luc报告基因载体图谱
cre-luc原理
cre-luc原理
CRE-luc是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因转录调控。
它基于Luciferase报告基因的表达来检测细胞内CRE结合蛋白
的活性。
CRE代表cAMP响应元件，是一种常见的转录调控元件，与cAMP响应元件结合蛋白（CREB）结合后可以调控靶基因的转录。
CRE-luc实验的原理是将CRE结合序列植入到Luciferase报告
基因的上游，构建成CRE-luc报告基因载体。
当这个载体被转染到
细胞中后，如果细胞内的CREB蛋白被活化并结合到CRE序列上，就
会促进Luciferase基因的转录和表达。
Luciferase是一种发光酶，它能够催化底物（如荧光素）的氧化反应，产生可检测的发光信号。
因此，通过测量细胞提取物的发光强度，可以间接地反映出CREB蛋
白的活性。
这种实验技术可以用于研究多种生物学过程，比如细胞信号传导、基因转录调控以及药物筛选等。
通过对CRE-luc活性的定量分析，可以揭示不同条件下CREB蛋白的活化程度，从而深入理解相关
基因的调控机制。
此外，CRE-luc实验还可以用于评估潜在药物对CREB活性的影响，为药物研发提供重要参考。
总的来说，CRE-luc
实验技术在生物医学研究中具有重要的应用意义。
报告基因
报告基因定义报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。
应用在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。
nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。
nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。
目前常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。
荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。
转录因子结合靶基因启动子的luc试验流程
转录因子结合靶基因启动子的luc试验流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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luc_报告基因质粒_doc
pRb-TA-luc(报告基因质粒)产品编号产品名称包装D2248 pRb-TA-luc(报告基因质粒) 1µg产品简介：¾pRb-TA-luc(报告基因质粒)是碧云天自行研发的用于检测Rb(retinoblastoma protein)转录抑制活性水平的报告基因质粒。
pRb-TA-luc是以碧云天的pGL6-TA质粒为模板，在其多克隆位点插入了多个Rb结合位点，可以高灵敏度地检测Rb的转录抑制活性水平。
Rb可以和E2F等转录因子结合，抑制这些转录因子的激活，抑制细胞周期的进展。
Rb同时也可以作为一个抑制性转录因子直接结合到其响应的顺式作用元件，抑制该基因的转录。
¾pGL6-TA质粒是用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因检测的新一代质粒。
该报告基因质粒比Promega公司的pGL3系列有了全面的改进，一方面对于luciferase的编码进行了改进，确保能更好地在哺乳动物细胞中进行表达，同时对整个质粒中所有可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理，在保持原有功能不变的情况下，使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到最低。
¾pRb-TA-luc质粒的主要信息如下：Base pairs 5677Rb response element 32-91Minimal TA promoter (pTA) 114-136luc2 reporter gene 178-1830SV40 late poly(A) signal 1865-2086SV40 early enhancer/promoter 2134-2552Synthetic neomycin phosphotransferase(Neor) coding region 2577-3371Synthetic poly(A) signal 3396-3444Reporter Vector primer 4 (RVprimer4) binding region 3511-3530ColE1-derived plasmid replication origin 3768Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region 4559-5419Synthetic poly(A) signal/transcriptional pause site 5524-5677Reporter Vector primer 3 (RVprimer3) binding region 5626-5645¾pRb-TA-luc质粒的图谱如下：¾pRb-TA-luc的多克隆位点及Rb response element的详细图谱如下：BglI KpnI NheI XhoI Rb response elememt1 GGCCTAACTG GCCGGTACCG CTAGCCTCGA GCCCGCGCGC CACCCCTCTGCCGGATTGAC CGGCCATGGC GATCGGAGCT CGGGCGCGCG GTGGGGAGACRb response elememt BglII51 GCGCCACCGT GCCCGCGCGC CACCCCTCTG GCGCCACCGT GAGATCTGCACGCGGTGGCA CGGGCGCGCG GTGGGGAGAC CGCGGTGGCA CTCTAGACGTHindIII Minimal TA promoter101 GAAGCTTAGA CACTAGAGGG TATATAATGG AAGCTCGACT TCCAGCTTGGCTTCGAATCT GTGATCTCCC ATATATTACC TTCGAGCTGA AGGTCGAACC¾pRb-TA-luc中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pRb-TA-luc)包括：Aat II Afl II Asc I Ase I Bsa I BsaA I BsiW I BspM II Eco72 I EcoR I EcoR V Mlu I Nde I Nru I PflM I Pme I Pml I Psp1406 I PspA I Rsr II Sac I Sma I SnaB I Spl I Srf I Tth111 I Vsp I Xcm I Xma I Xmn I¾pRb-TA-luc中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pRb-TA-luc once)包括：Sfi I GGCCN,NNN`NGGCC 9Bgl I GCCN,NNN`NGGC 9 Acc65 I G`GTAC,C 15 Asp718 G`GTAC,C 15 Kpn I G,GTAC`C 19 Nhe I G`CTAG,C 21 PaeR7 I C`TCGA,G 27 Xho I C`TCGA,G 27 Bgl II A`GATC,T 93 Hind III A`AGCT,T 103 BsrG I T`GTAC,A 669 Dra III CAC,NNN`GTG 1325 Gsu I CTGGAG 21/19 1558 Bpm I CTGGAG 22/20 1559 Apo I R`AATT,Y 1941 Mun I C`AATT,G 2005 BamH I G`GATC,C 2098 Stu I AGG|CCT 2531 EcoN I CCTNN`N,NNAGG 3052 BsiC I TT`CG,AA 3447 BstB I TT`CG,AA 3447 Sal I G`TCGA,C 3461 Afl III A`CRYG,T 3711 ApaL I G`TGCA,C 4025 HgiE II ACCNNNNNNGGT -1/134290 Not I GC`GGCC,GC 4531 BstE II G`GTNAC,C 4558 Ahd I GACNN,N`NNGTC 4633 Bsu36 I CC`TNA,GG 4989 Pvu I CG,AT`CG 5003 Sac II CC,GC`GG 5027 Bst1107 I GTA|TAC 5143 Xca I GTA|TAC 5143 Spe I A`CTAG,T 5462 BsmA I GTCTC`/9 5474 BsmB I CGTCTC 7/11 5475¾pRb-TA-luc质粒中推荐使用的测序引物序列如下：RVprimer3 (5626-5645):CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC¾pRb-TA-luc的全序列信息请参考碧云天的网站上该质粒的信息。
所有质粒载体汇总
酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：..pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103 JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro， pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo， pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1..哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc， pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，..腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）： pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
dual-luciferase
双荧光素酶报告系统作者：windyrain 2008-05-29 21:54:33标签：杂谈双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍有内参照双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。
载体图谱
一、pGADT7(Amp)酵母表达载体(AD-Amp)AD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'F：GC AT CGA TAC ATG GC T TG T GCTACTCTGAR：GGCC GGATCC TTAAGAGAGGTAGCTGGGAGAD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'二、pGBKT7(Kan0酵母表达载体(BD-Kan)三、BIFC(Kan)验证互做蛋白表达载体（德国）四、pGR107(Kan)表达载体（PVX-10kb）吴建国MCS:ClaI/SmaI/SalI(pgR107)MCS:ClaI/AscI/NotI/SalI(pgR106) 五、BIFC(Amp)载体（美国）3075（nEYFP-329bp）3076 (cEYFP-218bp)F：GGC GAATTC ATG GCTTGTGCTACTCTGA R：GGC CCTAGG AGAGAGGTAGCTGGGAG TAA TAG TGA六、RNAI(Kan)载体-pFGC5941（王宗华）七、pGEX-4T-1(Amp)原核表达载体八：pET-29a(Kan)原核表达载体九、. pEGAD(Kan)植物表达载体*XbaⅠ cleavage blocked by overlapping dam methylation. Must grow in dam-strain to cut. Note, XhoⅠ is not unique.pTRV2(a) Genome organization of TRV. The TRV-RNA1 open reading frames (ORFs) correspond to 134 and 194 kDa replicase, movement protein (MP) and a 16-kDa cysteine-rich protein. The TRV-RNA2 ORFs corresponds to coat protein (CP), and the 29.4 and 32.8 kDa proteins. gRNA, genomic RNA; sgRNA, subgenomic RNA. Asterisks (*) indicate the readthrough of 134 kDa protein.(b) TRV based VIGS vectors. TRV cDNA clones were placed in betweenthe duplicated CaMV 35S promoter (2×35S) and the nopaline synthase terminator (NOSt) in a T-DNA vector. LB and RB refer to left and right borders of T-DNA. Rz, self-cleaving ribozyme. MCS, multiple cloning sites.十、十一、1103-YFP十二：pBINPLUS十三、pBin438。
所有质粒载体汇总
酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：..pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103 JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro， pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo， pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1..哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc， pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，..腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）： pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
Promeg--双萤光素酶报告基因
• 除去培养基..PBS洗..在1XPLB中刮下细胞..细胞转移到试 管或小瓶中..1-2次冻融..检测
• 检测
双萤光素酶检测方案
1 支试管 2 步检测 30 秒钟
Luciferase Assay Reagent II
Passive lysis buffer
Stop&Glo Reagent
Dual-Luciferase®报告基因检测系统组分
• 检测缓冲液II • 底物（冻干粉） • Stop&Glo®缓冲液 • Stop&Glo®底物,50X • 被动裂解液,5X
Dual-Luciferase®报告基因检测步骤
• 裂解细胞
– 被动裂解
• 除去培养基..PBS洗..加1XPLB, 振荡15分钟..检测
Report Smartly －萤光素酶报告基因技术
自然界的萤光
发光真菌
发光节虫
发光海星
发光甲壳虫
自然界的萤光
发 光 鱼
发 光 甲 虫
自然界的萤光
萤 火 虫
报告基因的作用
• 细胞信号转导途径 • 启动子/增强子 • 受体结合 • 病毒/细胞相互作用 • 转录因子 • 药物诱导作用或”效果”
Luminescence vs. Fluorescence
Dual-Glo Assay: 同一样品中检测两种萤光信号
Cells in culture medium
Add firefly assay reagent
Primary reporter: Firefly bioluminescence
Add combination firefly quench reagent & Renilla assay reagent
双荧光素酶报告基因ppt课件
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2. 用途：
①基因转录调节的研究：最初的功能。 ②作为分子标记的应用：如利用 GFP 作为标记物检
测基因在植物 酵母和哺乳动物细胞中的转移。 ③生物大分子之间的相互作用：激活剂或拮抗剂在
改变活细胞中受体活性作用等方面的研究。 ④其他方面的应用：RNA 干扰研究、影像技术及药
注意事项：
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与
质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清
的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适
转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
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报告基因活性的检测：
商业的试剂盒 报告基因发光检测仪
注意事项： 内参的一致性。
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二、载体
定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩 增和表达的一类DNA分子。
特性： 1 复制起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、
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酶切注意事项（最好双酶切） 1. 酶的保存：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，
避免反复冻融。 2. 酶切反应体系：酶量不能超过反应体积的1/10。 3. 反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供。 4. DNA样品要求：一定纯度和浓度，不能混有酚、氯
仿、 EDTA、 SDS、 过多盐类等。 5. 温度和时间：通常37℃ 1-2h 6. 反应终止：EDTA 、SDS 、加热 、直接放入 -20℃ 7. 操作要求：无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。 8. 电泳鉴定酶切是否完全 。
所有质粒载体汇总
酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro， pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo， pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc， pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）： pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
荧光素酶报告实验
荧光素酶报告实验1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。
主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：第二种方法：1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。
酶切产物进行胶回收。
酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-nVector or DNA x Vector mNEB Buffer I或IV 2 DNA nSpe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1Pme I 1 T4 DNA Ligase 1Total voloume 20 Total voloume 101.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。
连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。
Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。
并扩繁阳性克隆。
重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；A 液B液pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μlpRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μlMimic/NC 100 nM终浓度OPTI-MEM 25 μl6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞；7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate；8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度；11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀；12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。
双报告基因原理
双报告基因原理实验原理整理荧光素酶报告基因Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。
荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。
然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。
荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。
应用原理转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。
某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
荧光素酶报告基因实验（luciferaseAssay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
双报告基因系统
双报告基因系统引言双报告基因系统（Dual-reporter gene system）是一种广泛应用于生命科学研究中的工具。
它通过使用两个不同的报告基因来同时检测和表达目标基因的活性。
这种系统可以提供更准确、灵敏和可靠的测量结果，并且广泛应用于基因调控研究、药物筛选、分子生物学、细胞生物学等领域。
本文将介绍双报告基因系统的原理、应用、设计和优点等方面的内容。
原理双报告基因系统一般由两个不同的报告基因构成，通常是荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 GFP）和荧光素酶（如火萤酶 Luc）。
这两个报告基因可以分别标记在目标基因的上游或下游区域，使得它们可以同时检测和表达目标基因的活性。
通常情况下，目标基因启动子或调控序列会被克隆到一个表达载体中，该载体中包含两个不同的报告基因。
当目标基因被激活或抑制时，两个报告基因的表达水平也会相应改变。
通过测量这两个报告基因的表达水平，可以间接获得目标基因活性的信息。
应用双报告基因系统在生命科学研究中有着广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：基因调控研究双报告基因系统可以用于研究基因的调控机制。
通过将该系统与不同的启动子或调控序列结合，可以研究不同基因调控元件对基因表达的影响。
通过测量两个报告基因的表达水平，可以评估基因调控序列的活性和响应特性。
药物筛选双报告基因系统可以用于药物筛选。
通过将该系统与特定的靶标基因结合，并同时测量两个报告基因的表达水平，在体外或体内评估药物对目标基因的调控效果。
这种系统可以快速筛选出对目标基因具有调控作用的药物，并且可以提供更准确的药物筛选结果。
分子生物学研究双报告基因系统可以用于分子生物学研究中的多种实验。
例如，可以通过该系统研究基因的启动子活性、转录因子的结合能力、信号通路的活性等。
该系统还可以用于检测基因的表达模式、细胞的转染效率等。
细胞生物学研究双报告基因系统可以用于细胞生物学研究中的多种实验。
通过将该系统与细胞标记试剂结合，可以追踪和定量细胞的增殖、分化和迁移等过程。
构建带luc细胞模型的流程步骤
构建带luc细胞模型的流程步骤构建带LUC细胞模型的流程步骤一、引言在生物医学领域，构建细胞模型是理解细胞行为和研究相关疾病发展的重要工具。
其中，带有荧光素酶(carrying the Luciferase gene，简称LUC)的细胞模型，通过其特有的荧光信号，可以实时监测细胞内的活动和生理过程。
本文将介绍构建带LUC细胞模型的流程步骤，以帮助您深入理解该过程。
二、所需材料1. 带有LUC基因的载体：选择合适的载体是构建带LUC细胞模型的关键。
常用的载体如pGL3基因载体。
2. 目标细胞：根据研究需求选择适合的细胞系，如肿瘤细胞系或正常细胞系。
3. 转染试剂：用于将LUC基因导入目标细胞中的试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质体或电转法试剂盒。
4. 培养基和培养器具：包括细胞培养基、无菌离心管、显微镜玻片等。
5. 荧光素酶底物：用于观测LUC活性的荧光素酶底物，如荧光素酶缓冲液和荧光素酶底物试剂。
三、构建带LUC细胞模型的步骤1. 细胞培养准备a. 将目标细胞系分离培养在含有适当培养基的无菌培养器中，保证细胞处于活跃生长状态。
b. 当细胞生长至合适的密度时，倒掉培养基，用生理盐水或无菌PBS洗涤细胞一次，去除残留的培养基。
c. 加入足够的胰酶-EDTA溶液用于细胞的离解，并放置在37℃恒温培养箱中进行消化，直到观察到细胞形态发生变化，并且细胞间脱落。
d. 加入足够的培养基以中和胰酶，并轻轻离心沉淀细胞，抛弃上清液。
e. 用适量的培养基重新悬浮细胞，并进行细胞密度计数。
2. LUC基因导入a. 准备转染体系，按照转染试剂的使用说明将转染试剂与LUC载体按比例混合，在室温下静置一段时间。
b. 将转染试剂和LUC载体混合物滴加到细胞悬液中，轻轻摇动培养器以保证混合均匀。
c. 将培养器中的细胞转移到无菌培养皿中，放置在37℃恒温培养箱中进行培养。
d. 根据转染试剂的指导，设置合适的转染时间。
一般来说，转染后24-48小时，LUC基因将会成功导入到细胞中。